基于深度学习的智能手机集成智能凝胶标签的便携式可视比率荧光设备用于检测农产品新鲜度

  摘要：本文构建了一种基于生物胺反应的智能手机辅助双色比率荧光智能凝胶标签视觉传感平台，用于实时评估农产品的新鲜度。绿色发射荧光碳点(CDs)与蓝色发射荧光双金属金属有机框架(Fe/Zr-MOF)耦合得到的双色CDs@Fe/Zr-MOF荧光纳米探针作为响应单元。随着SP和HIS含量的增加，CD的绿色荧光增强，而Fe/Zr-MOF的蓝色荧光被淬灭。因此，这种双色探针对生物胺具有清晰的荧光颜色响应。该纳米探针具有灵敏的颜色反应能力，在0-937.5 µM的宽范围内，SP和HIS的LOD值分别为0.17 μM和2.95 μM。此外，这些荧光纳米探针被固定在水凝胶载体上，冷冻干燥后可得到智能荧光水凝胶标签，实现了对猪肉和虾样品中SP和HIS的实时定性监测。

  策略1 基于CDs@Fe/Zr-MOF的深度学习辅助智能手机传感平台检测SP和HIS的示意图，以及使用CDs@Fe/Zr-MOF制作的智能标签检测肉类新鲜度的示意图

  在生物胺中，SP是肉类变质过程中产生较多的生物胺，而HIS则是对人体健康危害较大的生物胺。因此，作者提出了一个由深度学习和智能手机辅助的检测平台，用于检测SP和HIS。基于这一原理，创建了一种荧光智能标签来检测虾和猪肉的新鲜度。首先，合成了蓝色荧光铁锆有机框架(Fe/Zr-MOF)(方案1b)和绿色荧光碳点(CD)(方案1a)。这两种材料通过静电作用结合成双色荧光探针，即CDs@Fe/Zr-MOF(方案1c)。所合成的CDs@Fe/Zr-MOF复合材料不仅具有比率荧光传感器的优点，而且由于Fe/Zr-MOFs的吸附能力，可以很强地聚集目标分析物。加入SP或HIS后，系统的颜色由蓝色变为绿色。此外，在水凝胶上添加双色荧光探针后(方案1d)，得到的智能荧光水凝胶标签可用于定性监测新鲜度。智能荧光标签为新鲜度监测提供了一种新的可能性，具有一定的市场前景。

  图1 CD和Fe/Zr-MOF的表征

  首先，用TEM和SEM测量了尺寸特征和形态。CDs均匀分散，形态类似于球形点(图1a)。直径主要分布在1.0至5.0 nm之间(图1c)，平均直径为2.4792 nm。Fe/Zr-MOF呈纺锤形(图1d)，横向颗粒直径在349.74 nm至584.24 nm之间(图1f)，平均直径为457.4902 nm。图中的HRTEM放大CDs显示晶格间距为0.216 nm(图1b)，与面(101)相对应。测得的MOF晶格间距为0.202 nm(图1f)，对应于面(200)。此外，在EDS图谱(图1h)中，C、Fe、N和Zr元素分布均匀，这证明了双金属掺杂的成功。这一结果表明，双金属Fe/Zr-MOF已成功制备。

  图2 利用CDs@Fe/Zr-MOF荧光探针测定SP和HIS

  为了确定所提出的双色荧光分析系统的传感能力，在最佳实验条件下测量了不同浓度的SP和HIS系统的荧光发射光谱。从结果(图2a和2d)来看，随着SP和HIS浓度的增加，450 nm处的荧光强度逐渐被淬灭，而505 nm处的荧光峰增强。图2b显示了SP浓度与荧光强度比值(F508/F450)之间的关系。在SP浓度0-937.5 μM范围内，F508/F450与SP浓度呈良好的线性关系。线性方程为y = 0.00203x + 0.53543(R² = 0.99500)，检出限(LOD)为 0.17 μM(LOD = 3S/K，S代表三个空白样品的标准偏差，K为线性关系的斜率)。LOD与之前报道的大多数精胺分析方法相当甚至更低，线性范围与之前报道的分析方法相当甚至更大。将获得的荧光发射光谱转换为CIE色度坐标(图2c)。随着SP浓度从0 μM增加到937.5 μM，色度图上出现了明显的颜色变化。双色荧光探针从蓝色变为绿色，这与比色皿中观察到的颜色变化一致。

  在组胺浓度为0 至 937.5 μM的范围内，F508/F450与HIS浓度呈良好的线性关系(图2e)。其线性方程为y = 0.0009649x + 0.6021(R² = 0.9916)，最低检测限为2.75 μM。它的检测范围大于之前报道的许多组胺检测方法，其LOD与之前报道的大多数HIS检测方法相当甚至更低。线性荧光发射光谱被转换成CIE色度坐标(图2f)，正如预期的那样。当HIS从0 μM增加到937.5 μM时，在CIE色度图中观察到了明显的颜色变化，双色荧光探针的蓝色变成了绿色，与加入相应浓度组胺的溶液颜色基本相同。

  图3 用于SP和HIS检测的深度学习辅助智能手机传感平台

  为了实现现场检测，更好地利用荧光比检测，减少人眼的判断误差，成功构建了智能荧光传感系统。智能手机荧光传感系统包括3D打印盒子、智能手机、比色皿、电源、紫外光源和小程序。基于深度学习模型，借助智能手机拍照捕捉图像，小程序利用YOLO V3算法对系统图像进行分类并自动划分，利用图像处理算法提取HSV和RGB信号值。根据颜色变化，选择数据处理通道提取的信号值，拟合浓度与通道值之间的线性关系。小程序投入使用前，准备了大量深度学习模型。采集了111张荧光图片，包括不同荧光颜色、不同角度的各种杯体，分为40%的测试集和60%的训练集。将相册上传到小程序中，使用YOLO V3算法(图3)进行分类和标注，将输入图像大小调整为416*416，预测三个特征层(全局特征为13*13特征层，局部特征为26*26和52*52特征层)，达到较好的检测效果。

  具体操作流程如下：首先，将智能手机调整到最佳参数专业模式进行拍照。将合适的照片上传到小程序。在标签界面，为图片命名，并标注扦插数量。然后根据不同浓度的SP或HIS，设置相应的浓度。小程序使用YOLO V3算法对上传的图片进行自动分类，并识别比色皿。提取是根据插条的颜色和阴影进行的。该算法可识别每个样品池的RGB和HSV值。根据提取的比色皿，对应填充浓度。在小程序界面中显示每个试管的RGB。然后选择数据处理通道，其中包括H、S、V、R/B、G/B、G、S/V、R、B和(R + G)/B值。随着SP和HIS浓度的增加，插条的颜色由蓝色变为绿色，这是一个蓝色减弱、绿色增强的过程，因此采用G/B值对数据进行拟合。得出G/B值与SP或HIS之间的线性关系。线性方程和R2可直接显示在智能手机上，无需将数据导入电脑进行拟合。

  图4 微信应用程序的流程图

  依托上文提出的小程序，将双色荧光探针与深度学习辅助的智能手机结合起来的智能手机荧光传感平台投入使用。首先，通过智能手机拍照获取系统图像，然后将图像上传到微信小程序。利用YOLO V3算法对系统图像进行分类、提取并转换成RGB值。随着SP和HIS浓度的增加，双色荧光探针的蓝荧光被淬灭，即B值下降。同时，绿色荧光增强表明G值增加。因此，G/B值与SP和HIS的浓度呈线性关系。如图4所示，在0-1000 μM浓度范围内，G/B比值与SP浓度之间的等式为 y = 0.0005x + 0.4920(R² = 0.9953)。从图4可以看出，在0-1000 μM浓度范围内，G/B与HIS之间存在良好的线性相关关系，方程为y = 0.0003x + 0.6058 (R² = 0.9915)。与其他色度通道相比，G/B与SP和HIS的线性关系最好。上述结果表明，便携式智能手机辅助荧光传感平台在实时检测SP和HIS方面具有很大的应用潜力。

  图5 用于实际样品检测的智能荧光传感标签

  为了验证智能荧光标签的可行性并探索其普遍性，我们选择了猪肉和虾作为实际样品。首先，将质量相同的猪肉和整只虾放入培养皿中。然后将准备好的荧光水凝胶标签放入培养皿中，以避免样品与标签直接接触。之后，将用于实验的容器密封避光，并在三种不同温度(-20 ℃、4 ℃、35 ℃)下保存0-48 h(图5)。在此期间，在紫外线照射下，用智能手机拍照采集智能标签的荧光图像。不同培养皿中荧光标签的颜色从开始的蓝色，随着时间的推移，蓝色越来越深，逐渐变成蓝绿色，然后变成深绿色。除了紫外线下的图像，还收集了荧光灯下的图像。

  在35 ℃的储存条件下，随着储存时间的延长，猪肉的荧光标签由蓝色变为蓝绿色和深绿色。5 h的荧光标签呈现蓝色，并带有一丝绿色，表明猪肉已轻微腐烂。24 h后，荧光标签呈绿色，表明猪肉已经完全腐烂。随着时间的推移，猪肉在阳光下的颜色越来越深。在4 ℃的条件下，48 h后荧光标签呈现蓝色，并带有一丝绿色。在-20 ℃的条件下，荧光标签的颜色几乎没有变化，这不仅表明标签具有一定的检测能力，也表明了荧光标签在冷冻条件下的光学稳定性。猪肉标签的形状也没有明显变化。

  从虾在紫外灯下的图像可以看出，虾在35 ℃密封5 h后，其荧光标签变为蓝绿色，比同期猪肉中荧光标签的绿色更明显，说明虾比猪肉更容易变质。虾在阳光下的颜色变化不大。存放24 h后，荧光标签被虾腐烂产生的液体浸透，但仍能观察到绿色荧光。此时，虾在阳光下已变成红色。此后，荧光标签越来越多地被虾腐烂产生的液体浸透。荧光标签呈现出淡淡的墨绿色。虾肉在4 ℃储存24 h后出现蓝绿色。肉眼观察阳光下的虾肉似乎正常。储存29 h和48 h后，虾肉明显变黑，荧光标签也明显变绿，表明虾肉可能在之前的时间已经腐烂。上述在4 ℃下的贮藏表明，荧光标签比肉眼看到的要快一步。在-20 ℃下储存的虾的荧光标签在48 h内没有变绿，而是保持蓝色，表明虾在冷冻条件下没有腐烂。

  上述现象表明，肉类腐烂的开始时间和标签损坏程度都表明，肉类在较高温度下更容易产生BAs。荧光标签在各种条件下的光学稳定性。最重要的是，荧光标签具有一定的检测能力和良好的分析性能，可用于猪肉和虾肉的定性分析，为食品质量安全检测提供了可能。

  结论：

  1、本文研究了一种基于双色比率荧光探针的深度学习辅助智能手机集成光学平台，用于检测SP和HIS，从而实现肉类新鲜度的定性分析。

  2、利用绿色荧光CDs和蓝色荧光Fe/Zr-MOF的静电吸引和络合反应，构建了用于检测SP和HIS的稳健荧光传感分析平台。随着SP和HIS的增加，CDs的绿色荧光强度增强，而Fe/Zr-MOF的蓝色荧光被淬灭。SP和HIS的线性范围为0-937.5 μM。SP的检测限为0.17 μM，HIS的检测限为 2.95 μM，从而实现了对SP和HIS的准确检测。

  3、随着SP和HIS浓度的增加，荧光颜色系统由蓝色变为绿色。因此，利用智能手机的色度提取和处理功能，可以开发基于智能手机的便携式SP和HIS荧光检测和传感平台。根据荧光颜色的变化，提出了对肉类新鲜度进行定性分析的可能性。基于CDs@Fe/Zr-MOF设计的智能标签可实现食品新鲜度的实时分析。它具有操作简单、反应迅速的特点，具有一定的市场应用前景。

  参考文献

  LU Z, LI M, CHEN M, et al. 2023. Deep learning-assisted smartphone-based portable and visual ratiometric fluorescence device integrated intelligent gel label for agro-food freshness detection. Food Chemistry [J], 413: 135640.