“耐受保护伞”：纳米抗体光热侧流免疫法检测葡萄球菌肠毒素B

  背景：

  LFIA在多种极端条件下的稳定性对于确保实际检测的准确性至关重要，当今的主要解决方案是建立严格的试剂储存条件，并具有高效的探针保护机制，这通常会产生大量的额外成本。分子识别元件(通常是抗体、适配体和噬菌体)作为条带特异性捕获的贡献者，既是测定成功的关键决定因素，也是稳定性的限制因素。现代基因工程技术的发展为通过新型识别分子的开发和增强LFIA的稳定性提供了新的潜力。纳米抗体(Nbs)，是基于基因工程的新一代抗体，在对抗原亲和力和结构稳定性方面具有独特的优势，但它们作为识别元件在LFIA中的应用很少有报道，仍处于起步阶段。Nbs存在于骆驼和深海鱼类血清中，是最小的天然抗原结合区域，在广泛的极端条件(例如离子强度，pH值，温度等)下具有相对较高的抗原结合活性和出色的稳定性，并且易于以低成本大量生产。如上所述，Nbs的独特性质为增强LFIA的稳定性以构建更方便的POCT提供了潜在的生物学可能性，具有推动LFIA技术迭代的巨大潜力。

  除稳定性外，灵敏度是直接决定LFIA分析性能的另一个重要指标，代表试纸可以检测到的目标的最低浓度。近年来，随着对现代生物传感技术的深入探索，荧光、磁性、表面增强拉曼散射(SERS)、光热信号等技术作为比色信号之外的第二信号，提高了LFIA的灵敏度，双信号检测模式应运而生。其中，光热信号依靠光热材料的光热转换特性触发温度变化进行传感，由于便携式信号捕获设备的优点以及不受环境干扰和材料本身颜色的独立性，在双模LFIA中得到了非常热烈的反馈。相应地，对光热材料(主要是纳米材料或染料分子)的研究也已经出现并形成，在提高LFIA检测性能方面有许多应用。其中，分支等离子体纳米结构，如纳米花和纳米星，由于其表面具有尖锐的纳米特征并且位置紧密，有助于在粒子内部产生强大的电磁场，因此是有前途的光热转换材料。然而，由于衬底原子的高扩散系数和动力学控制的反应过程，高能面的生长速度往往比低能面快，这种具有高结构精度和可控性的各向异性支化纳米结构的大规模合成仍然具有挑战性。

  方法：构建了以Nbs为识别分子的光热侧流免疫分析，以全面提高LFIA的稳定性和灵敏度，并在葡萄球菌肠毒素B(SEB)中进行了概念验证。抗SEB(抗SEB Nb7)的Nbs在骆驼中成功饲养，并在之前的工作中被亚克隆和表达。通过简单的两步PDA辅助制备获得的金核-花瓣纳米颗粒(CPNs)是各向异性支化纳米结构，具有较高的结构精度和可控性，用于比色和光热双信号输出。

  图1.(A)获得纳米抗体的过程示意图。(B)CPN制备过程的示意图。(C)比色/光热双信号LFIA的原理和结果示意图

  结果：如图4A所示，随着SEB浓度从0上升到512 ng/mL，T线的蓝黑色逐渐加深，这是由于更多的SEB被固定在NC膜上的Nbs捕获后形成夹层结构。相应地，由于夹层结构的形成，图4B所示的HITC记录的光热图像(808 nm激光照射5 min后)也随着SEB浓度的增加而呈现温度逐渐升高(T线所在的位置由黄色变为白色)。比色和光热模式的目视检测限(vLOD)为2 ng mL⁻¹和1 ng mL⁻¹分别表明NLFIA的视觉灵敏度优于AuNPs-LFIA(vLOD为16 ng mL⁻¹如图4C所示)。为了更精确地评估NLFIA的检测性能，分别建立了T线强度和温度变化(ΔT)与SEB浓度的标准曲线。使用计算的检测限(cLOD)评估LFIA的灵敏度，该限由平均空白信号±3×空白的标准偏差确定。比色模式的拟合线性方程(图4D)可以定义为y= 279.51 lg(x)−1521.08 (R²= 0.9979)，计算出的检测限(cLOD)为1.68 ng mL⁻¹。

  图4. NLFIA用于SEB检测的分析性能。比色信号(A)、光热信号(B)和AuNPs-LFIA(C)的图片，比色信号(D)、光热信号(E)和AuNPs-LFIA(F)的校准曲线，NLFIA连续15天重复的稳定性(G，比色信号为蓝色，光热信号为红色)，NLFIA的特异性结果(H，蓝色为比色信号，红色为光热信号)， NLFIA检测SEB的回收实验(I)

  结论：提出了一种基于Nbs和金核瓣纳米颗粒(CPNs)的食品中SEB检测的新型光热侧流免疫法(NLFIA)，其中Nbs代替抗体作为LFIA的“耐受伞”。作为MRE，Nbs在结构上的天然优势导致在广泛的极端条件(例如离子强度，pH值，温度等)下具有更好的耐受性，并且对靶标具有更高的特异性，从而提高了LFIA的稳定性和特异性。采用PDA辅助两步法制备双信号示踪CPN。纳米花瓣结构和残留的PDA涂层在CPNs表面使材料具有良好的光热效应(η=49.43%)，使光热信号更灵敏。结合这些优势，NLFIA提供了更好的cLOD(1.68 ng mL⁻¹适用于比色模式和0.58 ng mL⁻¹对于光热模式)，在SEB检测中具有更高的环境耐受性和更高的特异性(几乎完全避免了SpA的干扰)，为食源性毒素的检测提供了更广泛的分析应用价值

  参考来源： Wu H, Li Y, Li Y, et al. The “umbrella of tolerance”: Nanobodies-armed photothermal lateral flow immunoassay for the detection of staphylococcal enterotoxin B[J]. Chemical Engineering Journal, 2023: 144273.