单叠氮丙啶染色和定量PCR联合检测环境水中的活大肠杆菌

  水中的粪便污染会导致各种病原体的传播，对人类造成疾病和健康风险。美国环境保护署(EPA)使用粪便指示菌(FIB)来监测水中的粪便污染，大肠杆菌是常用的指标之一。目前基于培养的检测大肠杆菌的方法存在局限性，例如潜伏时间长和依赖细菌代谢。而定量聚合酶链反应(qPCR)技术为大肠杆菌检测提供了一种更快、更准确的替代方案，但它在扩增活细胞的DNA同时也会扩增死细胞的DNA，从而导致活细胞数量被高估。这项研究的目的是开发一种单叠氮丙啶(PMA)-qPCR 检测方法，专门针对环境水域中活的大肠杆菌细胞，从而可以准确评估水质。

  作者首先通过 SYBR® Green qPCR 分析了 ycjM 引物对大肠杆菌和密切相关的志贺氏菌菌株的特异性.与 tuf 和 uidA 引物组相比，ycjM 引物组对大肠杆菌菌株表现出优异的特异性，仅扩增大肠杆菌(大肠杆菌 D8 除外)的 DNA，而不扩增密切相关物种志贺氏菌的 DNA。而来自鸭粪便中的大肠杆菌被扩增，可能是由于该菌株是先从环境中传播到动物肠道中，再从动物粪便中分离出来。

  在对PMA浓度进行优化时，在浓度到达5μM后，再次增加浓度未观察到Cq值显著性增加，且50 μM的PMA观察到对活细菌有细胞毒性作用。而光照时间在达到10min后，抑制作用也未增强。且该方法的检出限也可低至 102 CFU 活大肠杆菌纯培养物/100 mL。

  对于自来水(图a)活死菌混合组的Cq值显著低于其它两组，表明如果未使用PMA处理，qPCR会检测会显示出假阳性的结果。对于冬季收集的湖水(图b) ，两个PMA处理组之间有差距，即PMA无法有效的去除湖水中所有的死菌。对于夏季收集的湖水(图c) ，由于收集时，水体过于浑浊，因此对样品进行短暂离心，并将PMA的添加量增大到20mM。最终两个处理组之间发现了良好的一致性，即通过适当的预处理，PMA可以有效的抑104CFU/10mL的死大肠杆菌的扩增，即使是在有重度悬浮固体和其它背景微生物的情况之下

  总的来说，针对ycjM基因的PMA-qPCR检测方法可以对环境水域中存活的大肠杆菌(E. coli)细胞进行特异性检测和定量，并对水质进行更准确的评估。使用PMA作为活性染料与qPCR结合使用可以抑制死细胞的DNA扩增，并确保仅检测和定量活细胞。同时，PMA-qPCR 方法可在不同季节应用于各种类型的水样，包括自来水和环境水。且即使存在死细胞，它也可以有效检测出活的大肠杆菌细胞，根据样本类型和季节，检测限从102 CFU/100 mL到102 CFU/10 mL不等。PMA-qPCR 检测结果与基于培养的标准方法检测环境水中存活的大肠杆菌相当，这表明它有可能成为一种快速可靠的替代方案。