低浓度细菌的高通量检测对于公共卫生、食品安全和第一反应至关重要。发表在期刊《Biosensors and Bioelectronics》的文章《Multiplex bacteria detection using one-pot CRISPR/Cas13a-based droplet microfluidics》首次提出了一个基于液滴微流控耦合的平台。

  如图1所示，该文结合了一锅CRISPR/Cas13a测定和数字化微流体液滴，以实现对常见食源性病原体的多重、高灵敏度检测。在一锅CRISPR/Cas13a测定中(图1A)，首先对DNA靶标输入进行RAA预扩增，从而产生大量与T7启动子偶联的dsDNA。此后，通过T7转录产生可计数的单链RNA，并与Cas13a/crRNA特异性杂交以触发淬灭荧光报告基因的反式切割。一锅反应不仅降低了多步反应造成的污染和样品损失风险，而且使定量测量更加准确。为了在一个样品中进行多次并行检测并提高信号放大效率，进一步利用了基于液滴的微流控技术。如图1B所示，通过将每个液滴的目标引物序列封装成不同的颜色组合，然后将它们混合在单个管中以获得液滴库来进行液滴编码。将液滴库重新注入液滴合并芯片(图1C)并与含有靶标的CRISPR/Cas13a液滴进行混合。由于速度不同，两个液滴配对，并通过电极驱动触发合并。每个液滴作为单独的反应宿主，其中包含用于一锅CRISPR/Cas13a测定的原材料。在孵育过程中，在含有靶标的液滴内引发相应的反应并呈现荧光信号，而在没有靶标的情况下没有发生扩增，并且液滴没有点亮。通过液滴的颜色确定最终的目标细菌鉴定，并通过计数阳性液滴百分比来计算浓度，由泊松分布控制。通过这种方式，该液滴微流体系统通过用不同颜色编码和使用数字液滴放大的超灵敏检测实现了多路复用能力。

  图1基于CRISPR/Cas13a的一锅液滴微流控系统概述。(A)一锅CRISPR/Cas13a检测的概念。(B)编码液滴生成示意图。(C)基于CRISPR/Cas13a的液滴微流控系统的工作流程。

  参考文献

  [1] Shang, Yuting et al. “Multiplex bacteria detection using one-pot CRISPR/Cas13a-based droplet microfluidics.” Biosensors & bioelectronics, vol. 243 115771. 18 Oct. 2023, doi:10.1016/j.bios.2023.115771.