基于一锅CRISPR/Cas13a液滴微流控的多重细菌检测

  新型核酸技术的发展在一定程度上改善了传统的细菌检测方法存在的耗时，通量低，灵敏度差的问题。簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)以及CRISPR相关蛋白(CRISPR/Cas)系统为进一步的分子检测技术开辟了新的途径，但该类检测大多数用于定性测试，无法提供必要的定量结果用于监测治疗反应和基础生物学研究。此外，将信号放大和检测分为两个步骤，不仅为流式工作带来困难，而且使原始靶标浓度的量化不准确。近日，清华大学林金明课题组提出了一种将重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification，RAA)结合一锅CRISPR/Cas13a分析与微流控液滴编码策略整合，用于准确、灵敏地同时测定多种食源性病原体核酸检测的平台。该研究充分利用了CRISPR/Cas13a的信号放大优势和液滴限制效应，从而提高了检测灵敏度并实现了定量。同时，通过改变液滴的颜色，能够同时检测的细菌数量大大提高，可同时检测七种不同类型的食源性病原体。

  检测原理如图1所示，首先注入DNA靶标进行RAA预扩增，从而产生大量与T7启动子结合的双链DNA(图1A)。随后，通过T7转录生成可计数的单链RNA，并与Cas13a/crRNA特异性杂交，触发荧光报告子的反式切割。一锅反应不仅减少了多步反应的污染和样品损失的风险，而且使定量测量更加准确。为了在一个样品中实现多个靶标并行检测，提高信号放大效率，进一步利用了基于液滴的微流控技术。如图1B所示，使用不同颜色荧光染料标记各靶标RAA引物，通过将不同颜色的靶标引物序列包封进每个液滴完成液滴编码。然后将其在单管中混合，得到液滴库。将液滴库注入液滴合并芯片中，并与包含靶标的CRISPR/Cas13a液滴整合。两种液滴随机配对，并通过电级驱动触发融合。每个混合液滴作为一个包含反应原料用于一锅CRISPR/Cas13a检测的宿主。孵育过程中，在含有靶标的液滴内引发相应的反应并产生荧光信号，而在没有靶标的情况下不发生扩增，液滴不被点亮。通过液滴的颜色进实现目标细菌的鉴别，同时根据泊松分布计算阳性液滴百分比来计算目标细菌浓度。

  图1基于一锅CRISPR/Cas13a的液滴微流控系统原理概述。(A)一锅CRISPR/Cas13a检测的概念。使用单步反应来检测细菌，通过RAA产双链DNA，然后被转录成RNA，从而单步反应中激活基于Cas13a的荧光报告基因的切割。(B)编码液滴生成示意图。不同的靶标引物溶液与食用染料一起用油乳化成数千个编码的液滴，并进一步混合形成液滴库。(C)基于CRISPR/Cas13a的液滴微流控系统的工作流程。产生包含靶标的液滴，使用电极驱动以随机地将其与编码液滴融合以引发反应。孵育后，对单层液滴阵列进行明场和荧光成像分析以鉴别并定量靶标细菌。

  研究首先使用实时荧光检测验证一锅CRISPR/Cas13a检测的可行性，并通过琼脂糖凝胶电泳检测Cas13a的剪切活性，优化了检测体系的反应条件。

  图2  一锅CRISPR/Cas13a检测体系的构建和优化。(A)荧光分析一锅CRISPR/Cas13a检测的可行性。(B)琼脂糖凝胶电泳分析Cas13a介导的剪切检测。(C)热图分析特异性测定的荧光结果。优化(D)FQ5U报告浓度、(E)温度和(F)孵化时间。

  然后，构建了液滴编码和解码体系(图3)，并制备了微电极(图4)。

  图3 液滴编码和解码的示意图。(A)液滴编码策略的构建过程。(B)具有95%置信区间的液滴的RGB色彩空间差异。(C)液滴生成芯片产生的液滴的图像和大小分布。(D)使用Matlab脚本收集和解码彩色编码的液滴。(E)颜色识别的假阳性和假阴性百分比。

  图4 微电极模块的表征。(A)通过向微通道注入液体焊料来制造微电极的过程。(B)在触发和不触发合并条件下液滴的显微镜图像。(C)合并前后的液滴尺寸分布分析。(D)调整电极电压以启动液滴合并。误差棒表示合并直径的标准差。

  之后，评估了液滴微流控系统的检测灵敏度和特异性。首先，使用已知浓度的7种细菌(包括鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和蜡样芽胞杆菌)的连续稀释DNA样本来评估检测系统的定量能力(图5)。

  图5 液滴微流控系统进行细菌检测的评估。(A)测量浓度(Y)和输入浓度(X)之间的线性关系。插图是使用ST的DNA浓度系列稀释，用于单锅CRISPR/Cas13a检测的芯片的代表性荧光图像。(B)液滴微流体系统靶向细菌的特异性测试。(n = 3，误差棒表示测量的DNA拷贝数的变化)。(C)通过数字化一锅CRISPR/Cas13a和qPCR检测到的加标生菜中DNA浓度的热图。(D)数字化一锅CRISPR/Cas13a在检测8种食品样本中的性能结果，显示与qPCR结果100%一致。

  总的来说，本研究成功开发了一种基于液滴编码和一锅CRISPR/Cas13a检测的液滴微流控系统用于食源性病原菌的多重检测。使用不同的染料组合，可以显著提高一次实验同时鉴定的细菌的数量。结合一锅CRISPR/Cas13a检测，使得该系统具有特异性好，灵敏度高，快速，辅助设备简单等优良性能。此外，建立的平台具有强大的可操作性，能够根据特定的要求进行灵活调整，包括改变液滴大小和合并比例，从而扩大其应用范围。同时，该研究也存在可持续改进的空间，例如当前研究的定量检测仍是相对的，无法在同时针对多个靶标实现绝对定量检测。其次，该研究需要额外的设备，阻碍了实时现场检测。

  论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115771