基于“噪声净化器”的超灵敏智能手机辅助双色比荧光传感平台用于食品中致病菌的现场检测

　　摘要：荧光共振能量转移(FRET)中的非特异性结合仍然是食源性病原体检测的一个挑战，导致高背景信号。在此，我们创新性地报道了一种基于“噪声净化器"的双模态FRET传感器用于食品中大肠杆菌O157:H7的超灵敏定量检测。以多粘菌素B修饰的氮硫共掺石墨烯量子点(N, S-GQDs@PMB)为能量供体，适体修饰的黄色碳点(Y-CDs@Apt)为能量受体，构建了高效的FRET体系。磁性多壁碳纳米管(Fe@MWCNTs)被用作"噪声净化器"，以降低荧光背景的干扰。在背景净化模式下，FRET传感器的双模态信号的灵敏度均提高了一个数量级。此外，智能手机辅助的比色分析实现了实际样品中大肠杆菌O157:H7的护理点检测。所开发的基于“噪声净化器”的传感平台为各种食品中微量致病菌的超灵敏现场检测提供了一种有前景的方法。

　　图为基于“噪声净化器”的智能手机辅助双色比率荧光传感平台示意图。在这项研究中，我们首次构建了一种基于背景消除的FRET传感平台用于大肠杆菌O157:H7的超灵敏检测。其中，Fe@MWCNTs充当了"净化器"的角色。体系中未与目标菌结合的荧光受体由于π-π堆积作用被吸附在Fe@MWCNTs上，通过磁选被高效分离，从而降低了背景噪声干扰。另外，该传感器以N, S-GQDs@PMB作为能量供体，Y-CDs@Apt作为能量受体，巧妙的以菌为载体拉近两者的距离以触发高效的FRET，形成比率荧光模态检测平台。通过与便携式智能手机检测平台集成，在内置紫外灯的激发下，可以采集到大肠杆菌浓度依赖的视觉荧光图像。随后，使用安装的拾色器应用程序将图像转换为RGB值，以实现对大肠杆菌的现场定量分析。值得注意的是，这种基于智能手机的比率荧光策略在实际应用中显示出了良好的可行性和高灵敏度，对开发用于痕量检测大肠杆菌O157:H7的内置自校准生物传感器具有革命性意义。

　　上图为可行性验证实验结果。供体的发射光谱和受体的吸收光谱之间有一定程度的光谱重叠是分子间能量转移的必要条件之一。如图B所示，N, S-GQDs@PMB的发射光谱与Y-CDs@Apt的吸收光谱(带斜线的阴影部分)之间存在明显的光谱重叠。因此，N, S-GQDs@PMB作为荧光供体，而Y-CDs@Apt作为荧光受体。当检测体系中存在目标菌时，PMB和Apt分别在大肠杆菌O157:H7表面表现出广谱和高特异性的结合，进而缩短了N, S-GQDs@PMB和Y-CDs@Apt之间的距离(<10 nm)，使其满足FRET的发生条件。为了获得最大的能量转移效率，应选择一个合适的激发波长，保证N, S-GQDs@PMB获得最大荧光强度的同时避免对Y-CDs@Apt的直接激发。如图C和D所示，N, S-GQDs@PMB的最佳激发波长为355 nm，与能够驱动Y-CDs@Apt发出强荧光的荧光发射波长(422 nm)相对应。相比之下，在355 nm的激发波长下，Y-CDs@Apt的荧光发射强度可以忽略不计。因此，选择355 nm的激发波长可以有效避免光谱干扰，构建稳定的FRET反应体系。为了进一步研究能量转移效应，在激发波长为355 nm时，分别获得了N、S-GQDs@PMB、Y-CDs@Apt和FRET体系(N、S-GQDs@PMB + Y-CDs@Apt + 大肠杆菌 O157:H7)的发射光谱。N, S-GQDs的激发态能量可以通过分子间的偶极-偶极相互作用以非辐射的方式转移到Y-CDs。具体而言，外部光源激发N、S-GQDs从基态跃迁到激发态(N、S-GQDs*)，N、S-GQDs*吸收能量并将一部分或全部能量传递给Y-CDs，使Y-CDs被激发为Y-CDs*。激发态Y-CDs*跃迁回基态时，在566nm处产生大量荧光。如图E所示，N, S-GQDs@PMB的最大发射波长在422nm附近，Y-CDs@Apt的最大发射波长在566nm附近。在FRET系统中，N, S-GQDs@PMB的荧光强度明显下降，而Y-CDs@Apt的荧光强度则明显上升，这证实了它们之间的能量转移。

　　众所周知，多壁碳纳米管中呈六角形网格状分布的碳原子间形成了高度离域化的π键。这种微观上的独特性使MWCNT能够基于π-π堆积作用力吸附大量单链DNA核酸适体，而不需要提前将适体与MWCNT进行繁琐且昂贵的化学偶联。为了验证Fe@MWCNTs作为纳米载体和磁选剂的可行性，对其“吸附-解吸”能力进行了评价(图A)。如图F所示，在Y-CDs@Apt中加入Fe@MWCNTs可显著降低磁分离后上清液的荧光强度。这是由于核酸适配体在π-π堆积作用力下被吸附在Fe@MWCNTs表面，并通过磁分离被高效清除。将大肠杆菌O157:H7加入Y-CDs@Apt-Fe@MWCNTs中，37℃孵育60 min后，磁分离后的上清液荧光强度明显恢复。这是由于适体对目标细菌具有高亲和力。在将大肠杆菌O157:H7引入检测体系后，适体经历3D构象变化以产生靶标的特异性结合位点。Y-CDs@Apt从Fe@MWCNTs的表面“解吸”并与靶细菌高特异性结合，在磁性分离后保留在上清液中。上述结果表明Fe@MWCNTs可以实现“吸附-解吸”的自由切换，有效分离反应体系中未与目标菌结合的能量受体。解决了现有的FRET传感器应用于致病菌检测时，由供、受体非特异性吸附或反应空间狭窄造成的高信噪比问题，从而提高了检测灵敏度和线性响应范围。为了进一步验证整个反应体系的可行性，测定了空白对照和加菌样品的荧光光谱。如图G所示，在空白对照组中，Y-CDs@Apt由于 π - π 相互作用被吸附在Fe@MWCNTs表面，通过磁分离被去除。加入N, S-GQDs@PMB后，仅在422nm处显示出较高的荧光强度。而当E. coli O157:H7存在时，Y-CDs@Apt从Fe@MWCNTs上解吸附后，与N, S-GQDs@PMB共同捕获目标菌，供体和受体的空间距离被拉近，能量从N, S-GQDs@PMB被转移到Y-CDs@Apt上，导致422nm处的荧光强度衰减及566nm处的荧光强度增加。实验结果证实了所设计的平台用于检测E. coli O157:H7的可行性。此外，阴性结果的过低背景信号证明了“噪声净化器”的积极作用。

　　对传感器的分析性能进行了研究。基于FRET的传感器在检测有害物质方面发挥着至关重要的作用。遗憾的是，当应用于病原菌检测时，过高的背景信号会导致灵敏度低、响应范围小。受上述 "噪声净化器"的启发，我们提出了一种新模式，利用"噪声净化器"吸附反应体系中未与目标菌结合的荧光受体，降低荧光干扰，从而实现超灵敏荧光比色检测模式和双色可变智能手机设备辅助比色模式(图A)。在优化条件下，评估了NP-RF生物传感器和不含"噪声净化器"的RF生物传感器的灵敏度。对于不同浓度的大肠杆菌O157:H7.NP-RF生物传感器的比率荧光光谱如图B所示，在101-107 cfu/mL 范围内，检测到的信号(F566 nm/F422 nm)与目标细菌的浓度呈线性关系，方程为y=0.1503x-0.0475.R2=0.9967.检测限为4.45 cfu/mL(图C)。值得注意的是，RF生物传感器的线性范围为102-107 cfu/mL(y=0.1811x+0.0382. R2=0.9949)，检测限为4.74×101 cfu/mL(图E和F)。

　　众所周知，现场检测是人们梦寐以求的病原体控制技术。智能手机的发展催生了一种主要基于RGB信号输出的新宠检测策略。基于智能手机集成设备的RGB分析作为第二种检测模式，图D和G分别显示了植入"噪声净化器"的NP-on-site生物传感器和不植入"噪音净化器"的on-site生物传感器的检测结果。通过对比发现，随着大肠杆菌浓度的增加，NP-on-site生物传感器的颜色由蓝色逐渐变为黄色，与on-site生物传感器的浅黄色到黄色相比，具有更大的视觉检测优势。此外，通过智能手机自带的拾色应用程序读取颜色信号，发现获得的信号值R/B与目标细菌浓度有关。NP-on-site生物传感器的线性响应范围为101-107 cfu/mL(y=0.3345x+0.1440. R2=0.9869)，检测限为8.76 cfu/mL。而on-site生物传感器的线性响应范围为102-107 cfu/mL(y=0.3301x+0.4431. R2=0.9842)，检测限为9.75×101 cfu/mL。这些结果表明，"噪声净化器 "的应用有效降低了背景信号的干扰，扩大了目标细菌的响应范围，并将检测灵敏度提高了一个数量级。

　　在食品环境中，往往存在多种抗原位点相似的致病菌，检测平台的特异性也是评估检测效果的一个重要属性。用8株非大肠杆菌菌株和4株非O157:H7大肠杆菌菌株作为干扰菌，评价该生物传感器的选择性。如图H-J和图S10所示，大肠杆菌组的F566 nm/F422 nm值(NP-RF生物传感器)及R/B值(NP-on-site生物传感器)均大于其他组。相比之下，106 CFU/mL的干扰菌的信号输出与空白对照组之间没有显著性差异。这表明该测试平台对大肠杆菌具有较高的识别特异性。

　　结论：

　　1、我们成功设计并制备了一种基于“噪声净化器”的智能手机辅助双色比率荧光传感平台，用于选择性检测食品样品中的大肠杆菌O157:H7.该传感器利用具有高荧光发射效率的N, S-GQDs作为供体，筛选获得激发光谱与N, S-GQDs的发射光谱高度重叠的受体材料(Y-CDs)，保证了能量传递效率。

　　2、修饰在受体探针(Apt/Y-CDs)上的适配体通过π-π堆积作用被吸附在MWCNTs的表面，避免了昂贵和繁琐的化学偶联的同时实现了对Y-CDs@Apt的"吸附-解吸"灵活切换。MWCNTs经磁化后形成的Fe@MWCNTs具有反向磁吸能力，可作为“噪声清洁器”，解决现有的FRET传感器在病原体检测中由于高背景信号而导致的低灵敏度问题。

　　3、与RF生物传感器相比，NP-RF生物传感器具有更宽的线性范围(101 - 107 cfu/mL)和更高的检测灵敏度(LOD：4.45 cfu/mL)。

　　4、由于构建的双色比率荧光传感器呈现出浓度依赖性的颜色变化，利用智能手机集成装置进行比色分析可实现对大肠杆菌O157:H7的便携式现场检测。随着目标菌浓度的增加，NP-on-site生物传感器的颜色由蓝色逐渐变为黄色，与on-site生物传感器的浅黄色到黄色相比，具有更大的视觉检测优势。NP-on-site生物传感器在纯培养条件下的LOD为8.76 cfu/mL，实际样品的回收率和RSD分别为91-104%和3-8%。NP-现场生物传感器的检测性能明显优于现场生物传感器，进一步证实了生物传感器中"噪声净化器"的积极作用。

　　5、更经典的是，基于PMB(革兰氏阴性菌识别原件)和适配体的双重识别策略在致病菌检测中是前所未有的。通过替换适配体，结合基于“噪音净化器”的高效能量转移体系(N,S-GQDs/Y-CDs)，可实现对其他革兰氏阴性菌的高灵敏检测，在现场检测中具有广泛的应用前景。

　　参考文献

　　Cao, L., Ren, Y., Ling, N., Ye, Q., Wu, Y., Zhao, X., . . . Wu, Q. (2024). An ultrasensitive smartphone-assisted bicolor-ratiometric fluorescence sensing platform based on a “noise purifier” for point-of-care testing of pathogenic bacteria in food. Food Chemistry, 138805.

　　原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.138805.