基于新分子靶标的食品可添加乳酸菌PMA-qPCR活菌定量检测技术 (适用于复合益生菌产品中不同乳酸菌的鉴定和活菌计数)
发布时间:2023-12-22 浏览次数: 1527 来源: 刘振杰

核心提示:益生菌作为一类活的微生物补充剂,具有改善肠道菌群结构、增强机体免疫力、延缓机体衰老等多种功能,被广泛添加于各类食品中。当前,消费者饮食习惯逐渐向健康、绿色方向转变,益生菌产品市场不断扩大,新产品层出不穷。食品中可添加的益生菌种类繁多,传统检测方法存在生化鉴定和分类不够精准,检测周期长(4-7天)等问题。


  一直以来,复合益生菌产品中种群相近的益生菌无法分开计数的问题,一定程度上影响了企业产品质量评价和消费者信任,由于益生菌含量宣传与标签不符,而不被监管部门和市场认可的情况时有发生。新型PMA-qPCR实时荧光定量活菌检测技术可在复合益生菌产品活菌计数中应用,有效解决复合益生菌产品中多种种群相近益生菌无法分开计数的难题。

  【复合益生菌活菌计数难题】

  在国家“健康中国”战略、食品工业健康转型及技术创新等多方驱动下,益生菌产业已成为我国食品工业中增长较快、创新密集的产业。目前市场上销售的益生菌产品种类繁多,既有添加了活菌而且其数量在保质期内仍然存活的产品,也有添加了活菌但不能保证其销售时继续存活的产品。

  益生菌产品中“活菌数”是该类产品功能评价的一个关键技术指标,也是益生菌类保健食品质量的重要保证。复合益生菌产品是由多种不同菌株复配形成的,这些菌株可能包括种群相近的双歧杆菌、乳杆菌、乳球菌等对人体健康有益的菌。益生菌复合添加的理论基础是“不同的菌株对于塑造产品的功效作用不尽相同,综合使用多种菌株,协同发挥作用,进一步增强产品效果,可满足市场对于产品多方面的功能需求;不同菌株的生物学特性不同,综合使用也有利于产品货架期内保持益生菌总含量处于较高水平,保证产品货架期内的质量要求”。但是,在益生菌复合添加后产品中各益生菌株分开计数技术不成熟的情况下,难以验证货架期内各益生菌株含量的变化趋势和复合使用的协同效果,致使“益生菌总含量”成为益生菌产品品质和所宣称功效的唯一证明。

  所以,市场上也就出现了“十亿级”“百亿级”益生菌产品。益生菌市场急需高效稳定、分类精准的活菌计数方法作为技术支撑。


  通过比较基因组学分析,筛选乳酸菌特异性新分子靶标,结合PMA和qPCR荧光定量检测技术,具有更高的特异性和准确性,可实现复合益生菌产品中种群相似菌株的活菌计数,为行业企业益生菌产品生产质量控制提供技术支持,同时可更好地应用于监管部门的专项抽查、风险监控、企业自检等活动中。

  【可用于食品的菌种名单及可用于婴幼儿食品的菌种名单】

  2022年8月25日,国家卫健委发布2022年第4号公告:根据《中华人民共和国食品安全法》及其实施条例有关规定,为进一步规范《可用于食品的菌种名单》和《可用于婴幼儿食品的菌种名单》管理,审评机构组织专家对两个菌种名单进行了更新。

  更新后的可用于食品的菌种名单包括17个属38个种,可用于婴幼儿食品的菌种名单包括14个种。

  【基于新分子靶标的常见乳酸菌PMA-qPCR实时荧光定量活菌计数方法的应用】

  广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)(简称:广微测)在了解现有市场上流通的复合益生菌产品常用有益菌菌株的基础上,进行复合益生菌产品活菌计数方法研究,以期达到产品中多种种属相近益生菌分开计数的目的。经过方法研究和多批次试验样品的验证完成了“基于新分子靶标的常见乳酸菌PMA-qPCR实时荧光定量活菌计数方法”。

  (1)方法介绍

  qPCR是在标准 PCR 技术基础上,使用荧光报告基团( 包括双链DNA结合染料或在扩增过程中掺入PCR 产物、与PCR引物或探针结合的染料分子) 进行DNA扩增,利用具有热循环功能及荧光染料筛查能力的仪器,每次循环结束后通过荧光染料检测DNA 含量,荧光染料产生的荧光信号与生成的PCR产物分子(扩增片段) 数成正比。与传统PCR 相比,荧光定量PCR具有更高的特异性和灵敏度,检测周期更短、自动化程度高。PMA 是一种具有高亲和力的光敏性DNA结合染料,可有效抑制死菌DNA qPCR扩增,提高检测准确度。

  以往的乳酸菌分子鉴定中,PCR或qPCR扩增往往以16S rRNA、pheS、tuf等为靶标基因,这些片段的特异性不足够高,对于亲缘关系非常近的种,区分有一定难度。本单位开发的方法是基于乳酸菌比较基因组学分析挖掘乳酸菌特性新分子靶标基因,具有更高的特异性和可靠性,结合荧光定量qPCR检测技术,可实现食品等样品中常见乳酸菌精准、快速鉴定和批量化定量检测,辅助解决传统生化鉴定方法检测周期长、效率低、无法一次完成多种菌种鉴定和计数等问题。

  (2)方法的计数效果

  通过构建标准曲线,测定实际样品Cq值,并测算对应的活菌数,结果与平板计数结果相当。可实现复合益生菌产品中各益生菌株分开计数。

  (3)方法适用性

  本方法规定了益生菌制剂中常见菌种(双歧杆菌、乳杆菌和嗜热链球菌等)活菌实时荧光qPCR检测方法。

  本方法适用于益生菌制剂中双歧杆菌(青春双歧杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、动物双歧杆菌动物亚种、两岐双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌),乳杆菌(副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、产酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌)以及嗜热链球菌等乳酸菌定量检测。

  (4)方法的意义

  近年来,我国益生菌市场呈持续增长趋势,《2022年中国益生菌市场分析报告》数据显示,2017-2020年我国益生菌市场规模从553亿元增长至880亿元,年复合增长率约16.6%。益生菌品牌多,行业高速发展期部分企业出现野蛮生长态势,竞争激烈。

  益生菌新型检测技术的应用可促进益生菌行业检测技术的提升,提高企业和机构自我监测能力,同时可显著降低企业检测成本,提升产品质量和品牌声誉。

  联系方式:刘工 13724012098(微信同号)、陈工 17675631909(微信同号)

  座机:020-87137537

  传真:020-87688131

  联系地址:广州市越秀区先烈中路100号大院66号楼12层,广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)食品药品实验室

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