结肠直肠癌早期筛查及治疗新突破！

  结肠直肠癌是⼀种在结肠或直肠组织中形成恶性(癌)细胞的疾病，通常以结肠或直肠内称为息肉的生长开始。癌症预防是采取行动降低患癌症的机会。早期发现和治疗结直肠癌可以预防结直肠癌。筛查试验用于帮助早期发现结直肠癌并减少该疾病的死亡人数。癌症标志物(例如癌症抗原199:CA 199;甲胎蛋白：AFP;癌胚抗原：CEA)可以在患有癌症的身体(例如血液或尿液)中发现。CEA 是⼀种细胞表面糖蛋白，血清中CEA水平升高的情况常见于胃肠道及相关恶性肿瘤中。 临床研究还表明，血清CEA水平对于结直肠癌的分期预后以及治疗后复发疾病的鉴别有价值。因此，血清CEA水平的敏感性和特异性检测对于结直肠癌的早期监测，治疗评估和复发或转移非常重要。

  摘要：

  已经开发了基于酶标记或纳米标记的方法用于免疫测定，但是它们中的大多数具有低灵敏度并且不适用于低丰度蛋白质诊断和生物安全性保障的特点。在此，设计了⼀种创新型的石英晶体微量天平(QCM)免疫传感方法，通过用辣根过氧化物酶(HRP)纳米粒子作为增强剂，高效检测结直肠癌患者血清样本中的癌胚抗原(CEA)，伴随在抗CEA捕获抗体缀合的QCM探针上的酶促生物催化沉淀(EBCP)，生成沉淀4-氯-1-萘酚(4-CN)。最初，在戊二醛交联的帮助下，基于反胶束法合成HRP 纳米球，然后共价缀合到多克隆抗CEA 检测抗体上。通过将单克隆抗CEA 捕获抗体固定在L-半胱氨酸修饰的金底物上来制备QCM免疫传感探针。在靶CEA 存在下，于捕获抗体和检测抗体之间进行夹心型免疫反应，从而导致HRP纳米球附着在金探针上。在QCM电池中加入4-CN 后，携带的HRP纳米球催化4-CN 氧化， 以在金电极上产生不溶性沉淀物，从而引起频率的变化。相对于传统的HRP标记策略和直接抗原-抗体反应，HRP纳米球获得了改进的分析特征。采用HRP纳米球标记方法，研究了影响免疫分析性能的因素。抗体与HRP纳米球和金底物的共价缀合实现了良好的可重复性和中间精度，低至10.7%。在最佳条件下，QCM免疫分析的频率变化与0.01-100 ng/mL动态线性范围内的靶CEA 浓度成正比，检出限值(LOD)为7.8pg/mL。此外，开发的QCM免疫测定显示出高特异性和常期储存稳定性，并且可以用于分析⼈血清样品，与从商业酶联免疫吸附测定(ELISA)方法获得的结果相比具有⼀致的结果。

  方案1使用辣根过氧化物酶纳米颗粒(HRPNPs)和酶生物催化沉淀的癌原增石英晶体微平衡免疫分析(QCM)示意图： (A)反向胶束法制备HRPNPs，HRPNPs与多克隆抗CEA检测抗体(pAb2)生物偶联;单克隆抗CEA抗体(mAb1)涂层的QCM传感器与HRPNP酶对4-氯1-萘酚的生物催化沉淀(4-CN)进行(B)三明治型免疫分析。

  在此，作者提出了强大且可行的QCM 免疫测定的概念验证，结合双重扩增策略(方案1)，在单克隆抗CEA 捕获包被抗体的探针上，灵敏检测生物体液中CEA。首先通过反胶束法合成HRP 纳米球，并与多克隆抗CEA 检测抗体功能化。加入靶CEA 后，HRP纳米球通过特异性抗原-抗体反应附着于探针，以进行质量变化中QCM传感的第一次信号扩增。随后，携带的HRP纳米球借助于H2O2将4-CN 氧化成不溶性苯并-4-氯-己二烯酮，H2O2沉积在QCM探针的表面上进行第二次信号扩增。HRP纳米球质量的增加及其沉淀导致石英晶体的共振频率(f)变化，f与样品中的CEA 的水平成比例。这项工作的主要目的是与纳米标记，酶标记和酶促生物催化沉淀技术相结合，探索一种新的信号扩增策略，用于QCM免疫传感低丰度蛋白质。

  图1(A)-半胱氨酸修饰金底物(插图：清洁金底物)和(B)mAb1/(A)-半胱氨酸/Au;(C)HRPNPs的(C) TEM图像[插图：(a)pAb2、(b) HRPNP悬液和(c) HRPNP-pAb2的(a) pAb2样品和(b) HRPNP + TMB +过氧化氢];(D)紫外-可见吸收光谱。

  金底物(图1A，插图)，L-半胱氨酸通过Au–S 键与金底物缀合后，表面变得粗糙(图1A);特别是，当mAb1 抗体与L-半胱氨酸修饰的金表面共价缀合时，粗糙的尤为明显(图1B)。原因在于(i)L-半胱氨酸是一种小分子，和(ii)抗体的分子量/ 大小远远大于L-半胱氨酸。

  接下来，我们使用TEM来研究合成后的HRPNP(图1C)。显然，大多数HRP纳米粒子在PBS(10 mM，pH 7.4)中分散良好，平均粒径为直径~30 纳米。众所周知，HRP可以在过氧化氢(H2O2)存在下容易地将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)氧化成蓝色分子。一个令⼈费解的问题是，合成的HRPNPs是否可以保持天然的催化活性。为了验证这个问题，一定量的HRPNPs与含有TMB 和H2O2的混合物反应。相对于单独的HRPNP溶液(图1C，插图'a')，加⼊TMB和H2O2后出现醒目的蓝色产物(图1C，插图'b')。

  图2(A)，一个干净的金电极(Au)的(A)循环伏安图(CVs)， ，(b)L-半胱氨酸/Au和(c)mAb1/L-半胱氨酸/Au在PBS(10 mM，pH 7.4)中，含5.0mMFe(CN)6 4−/3−，50 mV/s; (B) QCM响应(频率与时间)(a) mAb1/L -半胱氨酸/Au, (b) mAb1/L -半胱氨酸/Au + 1.0 ng/mL CEA, (c) CEA/mAb1/L -半胱氨酸/Au + HRPNP-pAb2, and (d) HRPNP-pAb2/CEA/mAb1/L -半胱氨酸/Au + 4-CN + H2O2; (C和D)HRPNPpAb2/CEA/mAb1/l-半胱氨酸/Au在(C)前和(D)酶催化沉淀后的扫描电镜图像。

  2A显示了金底物在包含5.0mM Fe(CN)64−/3−的PBS(10 mM，pH 7.4)中每个组装步骤后的循环伏安图。在洁净的金电极上观察到具有扩散限制氧化还原过程的明确定义的CV(相对于Ag/AgCl)(曲线'A')。此外，金电极上L-半胱氨酸(曲线'b')和mAb1(曲线'c')的逐步修饰随着氧化还原探针的阴极波和阳极波之间的峰电流降低和峰-峰分离电位增加， 这与组装这些层时增强的电子转移屏障是一致的。由于L-半胱氨酸可以作为电子转移过程中所谓的启动子27， 因此降低的峰值电流并不明显;特别是，当mAb1 抗体组装到电极上时，由于其为导电性弱的生物大分子(曲线'c')，所以伏安峰值电流大大降低。在这方面，mAb1/L-半胱氨酸/ ⾦可用于检测靶CEA。

  图3以1.0ng/mL CEA为例，(A)免疫反应时间和(B)沉积时间对QCM免疫传感器分析性能的影响。

  图4免疫传感器对不同浓度CEA标准品的(A) QCM响应(频率与时间);(B)标定图;QCM免疫传感器的(C)特异性;HRPNPpAb2和mAb1/L-半胱氨酸/Au在4°C下的(D)存储稳定性。

  如图 3A所示，在30分钟后达到稳定频率。事实上，较常的免疫反应时间不会导致频率的显著增加。为了节省测定时间并获得足够的信号，我们在这项工作中选择免疫反应时间为35分钟。影响QCM分析性能的另一个因素是沉积时间。短的沉积时间不利于形成不溶性苯并-4-氯己二烯酮。 图3B显示了QCM频率对沉积时间的依赖性。频移随着沉积时间的增加而增加，并在12分钟后趋于平 稳。类似地，酶促生物催化沉淀时间为15分钟。为了评估开发的QCM免疫传感器的灵敏度和定量范围，我们在最适条件下将HRPNP-pAb2用作信号放大，伴随酶促生物催化沉淀，用不同浓度的 mAb1/L-半胱氨酸 /金测定常规CEA标准品。稳态频率随着样品中CEA水平的增加而增加(图 4A)。曲线不是线性的，正如通常观察到的免疫分析，我们使用曲线拟合的校准程序。如图 4B所示，然而，频移(相对于背景)和CEA浓度的对数之间具有良好的线性关系，可以拟合 0.01⾄100ng/mL的实验数据点。在信噪比为3时，检测限值(LOD)评估为 7.8pg/mL。线性回归程方为 ΔF (Hz) = (95.1 ± 4.4) + (44.3 ± 3.1) × log C[CEA] (ng mL−1 ; r = 0.9926, n = 5). 为了进一步阐明开发的QCM免疫测定的信号放大效率，我们将自己的策略的分析性质与其他CEA免疫测定的分析性质进行了比较。表1总结了线性范围和LOD等特性。可以看出，我们系统的LOD与其他检测方案相当。更重要的是，QCM免疫测定的LOD。

  结论：

  总之，这项工作设计了一种新的QCM免疫检测方案，该方案具有多信号放大策略，用于对结直肠癌患 者血清样本进行低丰度CEA的敏感筛查。该系统由QCM免疫传感探针和 HRPNP-pAb2信号标签组成，而该测定涉及夹心型免疫反应和酶生物催化沉淀。与传统的酶联免疫分析相比，本研究的重点如下：(i) 具有高催化效率的HRPNP可用于信号放大，因为纳米颗粒中容纳了大量HRP分⼦;(ii)不溶性沉淀的酶促生物催化沉淀技术可用于进一步放大可检测信号。然而，我们系统的⼀个缺点是，在测量过程中不能重复使用所制备的免疫传感界面。

  参考文献：Liangjie, Chao Xu, Shuyuan Li, Xiangyu Wang,a Dianping Tang c and Fangqin Xue. In situ amplified QCM immunoassay for carcinoembryonic antigen with colorectal cancer using horseradish peroxidase nanospheres and enzymatic biocatalytic precipitation. Analyst, 2020, 145, 6111–6118 | 6111.

  DOI：10.1039/d0an01399d.