新型CRISPR–Cas系统活性的结构基础

　　CRISPR – Cas是细菌和古菌抵抗外源基因入侵的适应性免疫系统。根据Cas效应蛋白的不同，将其分为2大类共七型。其中，第1类系统由多个效应蛋白与向导RNA组成复合体行使功能，包括I、III、IV和VII型;第2类系统由单个效应蛋白与向导RNA形成复合体，包括II、V和VI型。例如Cas9、Cas12和Cas13分别为II、V和VI型系统的效应蛋白，是广泛应用的DNA和RNA编辑工具。目前，I–VI型系统的功能和机制研究相对深入，然而，Ⅶ型作为一种候选CRISPR-Cas系统，其生物学功能和分子机理尚不清楚。

　　2024年8月14日，天津医科大学基础医学院生化系/天津市免疫学研究所张恒团队联合中国科学院武汉病毒研究所邓增钦团队，在 Nature期刊发表了题为：Structural basis for the activity of the type VII CRISPR-Cas system 的研究论文。

　　综上，该研究首次对Ⅶ型CRISPR–Cas系统的功能进行了表征，深入阐明了这一系统独特的组装机制、底物RNA识别和切割模式，为基于VII型CRISPR系统的RNA操控工具在生物技术应用中的设计与开发奠定了基础。

　　该研究发现，与其它1类CRISPR系统的显著区别是，候选的VII型CRISPR复合体对核酸酶(Cas14)的招募依赖于底物RNA与crRNA序列的互补配对。细胞功能实验进一步证实，这一复合体能够序列特异性识别细胞内转录本，靶向敲低基因表达，并能够对抗噬菌体对宿主大肠杆菌的感染，是具有适应性免疫功能的真正CRISPR系统。底物RNA依赖的复合体组装使这一系统有可能被进一步开发成为高精准可编程的RNA靶向编辑工具。

　　图1：VII型CRISPR – Cas系统的RNA靶向识别与切割。a, VII型系统可特异性敲低红色荧光蛋白和卡那霉素抗性基因的表达;b, VII型系统可抵御RNA噬菌体MS2的感染;c, 核酸酶Cas14与Cas5-Cas7-向导RNA的结合依赖于靶点RNA的存在;d, Cas14的RNA酶活性。

　　为阐明VII型CRISPR-Cas系统切割底物RNA的分子机制，并进一步探究其应用于基因编辑的可能性，研究团队对宏基因组来源的VII型系统复合体进行了生化表征及结构解析，共得到7种不同功能状态的高分辨电镜结构。这一分子量超过500 kDa的复合体由7个Cas7蛋白、1个Cas5蛋白、4个Cas14蛋白以及crRNA和底物RNA构成。与其它CRISPR系统不同，VII型系统通过一种独特的核酸酶Cas14执行切割底物RNA活性，对单链和双链DNA无切割作用。Cas14在溶液中形成四聚体，具有Zn2+依赖的RNA内切酶及5'→3'外切酶活性。

　　图2：VII型CRISPR–Cas复合体底物结合状态I的密度图(a)和结构模型(b)

　　底物靶序列两侧的序列(protospacer flanking sequence， PFS)的存在往往限制了CRISPR工具对靶点的选择性。团队通过功能研究和结构验证，发现VII型系统区别于其它CRISPR – Cas系统的另一个特点是，3'-PFS对底物切割无影响，5'-PFS则可以通过增加VII系统复合体中Cas14的结合位点影响对RNA底物的切割。基于以上细胞功能、生物化学和结构生物学研究，团队较为深入的阐明了VII型系统的工作机理和结构基础。VII型系统的以上三个独特之处，使其有可能成为非常有潜力的新型RNA编辑工具。

　　图3：VII型CRISPR – Cas系统的工作机理

　　综上，该研究首次对Ⅶ型CRISPR–Cas系统的功能进行了表征，深入阐明了这一系统独特的组装机制、底物RNA识别和切割模式，为基于VII型CRISPR系统的RNA操控工具在生物技术应用中的设计与开发奠定了基础。

　　论文链接：

　　https://www.nature.com/articles/s41586-024-07815-0