利用高响应性生物传感器对体内外乳酸代谢动力学的全面、多尺度分析

乳酸作为一种关键的糖酵解代谢产物，在多种生理和病理过程中起着核心作用。然而，由于缺乏一种高性能的工具，对体内外乳酸代谢动力学的全面多尺度分析至今仍是一个尚未解决的问题。研究人员最近开发了一系列基因编码的乳酸树脂传感器，名为FiLa，用于阐明细胞、亚细胞细胞器、动物、人类血清和尿液中的乳酸代谢。在本方案中，介绍了基于FiLa传感器的实时亚细胞生物能量融合分析策略，通过分析不同营养和药理条件下的乳酸代谢反应，首次提供了亚细胞尺度上细胞代谢功能的系统水平视图。还报道了通过细胞微胶囊系统或重组腺体相关病毒成像活小鼠乳酸动力学的详细程序，以及对人体液体中乳酸的快速、简单的测定。这种综合的多尺度代谢分析策略也可应用于其他使用各种分析平台的代谢物生物传感器，进一步扩大其可用性。该协议适合于在生物化学、分子生物学和细胞生物学方面有专业知识的用户。通常，表达FiLa的细胞或小鼠的制备需要2天到4周，活细胞和体内成像可以在1-2小时内进行。对于基于FiLa的体液测定，整个测量过程通常一个样品手动测定大约1分钟，或96个自动微孔板测定样品大约3分钟。

关键发现：

1、 高响应性FiLa生物传感器的设计与开发

图1 各种营养条件下的亚细胞乳酸代谢成像

尽管需求旺盛，但在活细胞和体内追踪乳酸的工具是有限的。传统的生化方法，如酶循环分析、色谱和质谱分析，已常规使用多年。用同位素标记的乳酸培养细胞，并通过质谱定量代谢组，可以跟踪乳酸代谢变化。然而，所有这些方法都在样品制备过程中需要细胞裂解，因此失去了关于乳酸的空间分布和时间动态的信息。此外，这些方法时间较长，不用于活细胞和体内的定量、实时高通量筛选。近年来，海马分析仪已成为一种非侵入性工具，并已越来越广泛地应用于代谢研究。然而，该测定方法依赖于细胞外酸化率的测定，而不直接测量乳酸水平。虽然细胞外乳酸水平通常与细胞内水平相平衡，但这种平衡并不总是正确的。此外，海马分析仪测量的是细胞群中乳酸的平均水平，而不是单个细胞，并且不能识别单个亚细胞室或体内的乳酸丰度。

在以往的研究中，大肠杆菌LldR在乳酸反应中表现出显著的构象变化；因此，它是一个很有前途的传感器设计候选者。为了开发高响应的乳酸传感器，我们首先设计了90个嵌合蛋白，将循环排列的黄色荧光蛋白（cpYFP）插入到LldR的两个完整或截断的亚基之间，或位于LldR的随机螺旋环上有或没有DNA结合域的氨基酸残基之间。有趣的是，在截断的LldR中插入cpYFP的Y186/P189嵌合体在添加乳酸后显示~荧光增加了200%。然后，我们在LldR的182-189个残基区域创建了一系列该嵌合体的截断变体，发现M185/P189变体在乳酸作用下表现出~420%的荧光增加。为了进一步扩展传感器的动态范围，我们以M185/P189嵌合体为基础，建立了一个针对P189和P190残基的随机突变体（~700变体）库。其中，P189M/P190D、P189H/P190D和P189F/P190D的动态范围分别为~740%，~1400%和~2600%，他们的亲和力~20-30 μM，远低于生理浓度（0.8-2毫米，0.6-1毫米在哺乳动物细胞）。因此，为了调整这些乳酸传感器的亲和力，我们接下来基于P189M/P190D、P189H/P190D和P189F/ P190D嵌合体创建了一个靶向M185的位点饱和突变体库，它们对乳酸的亲和力在19-1000 μM之间。考虑到响应性、选择性和亲和性，我们最终选择了P189F/P190D、M185L/P189H/ P190D和M185A/P189M/P190D变体，分别标记为FiLa-H、FiLa和FiLa-L进行进一步研究。

2、 基于FiLa传感器的综合多尺度分析策略

图2 不同代谢调节剂对亚细胞乳酸水平的影响

为了研究亚细胞乳酸代谢是如何调节的，我们已经能够将该系统开发为高通量、基于细胞的化学遗传分析，并研究不同化学调节剂对四个亚细胞隔间（即细胞质、细胞核、线粒体和细胞外空间）乳酸水平的影响。这一策略使我们能够证明在大多数情况下乳酸代谢向相同的方向变化；然而，它可以根据亚细胞室发生动态变化。例如，如预期的那样，乳酸脱氢酶抑制剂降低了所有四个隔间的乳酸水平，而复合物I抑制剂鱼藤酮由于所有糖酵解的代偿性上调而增加了所有四个隔间的乳酸水平。然而，单羧酸转运体（MCT）抑制剂AR-C155858降低了其他三个室的细胞外乳酸水平，增加了三个室的乳酸水平。

结论

基于FiLa的分析方法优于目前主流的乳酸分析方法。例如，色谱和质谱需要细胞或组织裂解，因此会失去时空信息，而海马分析仪基于细胞外酸化率的测量来推断糖酵解活性。相比之下，FiLa传感器在亚细胞分辨率下实时监测乳酸动态。此外，它们允许在体内成像，这是以前现有的方法不可能实现的。重要的是，这种强大的生物传感器分析方法比质谱技术和海马分析仪更快、更容易使用。因此，FiLa传感器为定义健康或疾病中乳酸代谢的时空景观提供了强大的、广泛适用的工具，并将为基础、转化和临床研究中乳酸代谢的精确研究铺平道路。我们预计这些传感器将受到细胞代谢领域研究人员的青睐，并得到广泛应用。这种方法也可以适用于不同的基因编码荧光传感器使用不同的分析平台，如酶标仪，荧光显微镜，高含量成像系统和体内小动物成像系统。由于乳酸代谢的核心重要性，该方案提供的FiLa检测有望成为生物学家和转译和临床研究人员所青睐的工具。

原文：Wang, A., Zou, Y., Liu, S., Zhang, X., Li, T., Zhang, L., Wang, R., Xia, Y., Li, X., Zhang, Z., Liu, T., Ju, Z., Wang, R., Loscalzo, J., Yang, Y., & Zhao, Y. (2024). Comprehensive multiscale analysis of lactate metabolic dynamics in vitro and in vivo using highly responsive biosensors. Nature protocols, 19(5), 1311–1347. https://doi.org/10.1038/s41596-023-00948-y