耐辐射细菌大战噬菌体：揭秘CBASS防御系统

耐辐射细菌及其噬菌体

耐辐射细菌是一类能在高辐射等极端环境中生存的微生物。它们通过高效的DNA修复系统、较厚的细胞壁或保护性外层以及复杂的抗氧化系统等机制来抵御辐射的有害影响。这些细菌在多个领域具有潜在应用价值，因此引起了科学界的广泛关注。然而，除了高辐射压力外，捕食性噬菌体也是它们面临的重要威胁。在长期的选择压力下，细菌已经进化出多种防御系统来对抗噬菌体感染。其中，CBASS（cyclic oligonucleotide based anti-phage signaling system）是一种广泛分布于细菌中的抗噬菌体信号系统，能够合成多种基于核苷酸的信号分子来介导免疫。此项研究聚焦于乌鲁木齐德沃斯氏菌中CBASS系统的传感器CD-NTase及其效应因子Cap5的结构和功能。

CBASS传感器DwCdnB可以结合所有四种核糖核苷酸

研究人员采用了等温滴定微量热法（ITC）。这种方法使他们能够测量非水解性ATP、GTP、UTP和CTP类似物与DwCdnB的结合强度（亲和力）。结果表明，所有这些核糖核苷酸类似物与DwCdnB的结合常数（KD）相似，表明它们具有相似的结合亲和力。重要的是，DwCdnB是首个被发现的能够识别所有四种核糖核苷酸作为底物并具有微摩尔亲和力的环二核苷酸（CDN）合成酶（CD-NTase）。

DwCdnB酶在与不同核糖核苷酸（ATP、GTP、UTP、CTP）及金属离子（^Mg2+或^Mn2+）孵育时，能够合成多种环二核苷酸（CDN）产物。特别是，在^Mg2+存在下，DwCdnB能高效合成3',3'-环二腺苷酸和3',3'-环二鸟苷酸，但对3',3'-环二尿苷酸和3',3'-环二胞苷酸的合成效率较低。然而，当用^Mn2+替代^Mg2+时，DwCdnB对后两种CDN的合成效率显著提高。这些结果揭示了DwCdnB具有底物混杂性，能够催化生成多种CDN产物，这与先前报道的CD-NTase有所不同。

DwCdnB的整体结构

为了揭示DwCdnB的分子结构和催化机制，研究人员通过结晶技术获得了无底物和底物结合状态下的DwCdnB晶体。他们制备了两种形式的晶体：一种是硒代蛋氨酸衍生的DwCdnB（SeMet-DwCdnB），另一种是与Anderson-Evans型多钨酸盐结合的DwCdnB（DwCdnB-TEW）。通过X射线衍射分析，获得了这两种晶体的高分辨率结构。其中，DwCdnB-TEW晶体结构显示了TEW分子与DwCdnB的核苷酸结合口袋之间的氢键相互作用。由于SeMet-DwCdnB和DwCdnB-TEW的结构高度相似，因此采用了分辨率更高的SeMet-DwCdnB结构进行后续分析。DwCdnB酶具有独特的双结构域架构，包括N端的核苷转移酶结构域和C端的螺旋束结构域，整体呈现组成型活性状态。该酶的关键活性位点由三个保守的天冬氨酸残基组成，它们位于中央β-折叠片中，对于金属离子的配位以及受体核苷酸2'-OH/3'-OH的去质子化至关重要，这是进行核苷转移反应的基础。此外，DwCdnB还包含位于中央β-折叠片相邻短α-螺旋上的保守GS基序，这一结构特征可能与其功能相关。

DwCdnB通过与核糖2'-OH的金属配位区分核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸

通过确定DwCdnB与不同核糖核苷酸（ATP和dATP）在^Mg2+存在下的复合物结构，深入理解了其底物混杂性。结构分析表明（图1），DwCdnB能够结合两个ATP/dATP分子和两个^Mg2+离子，并通过一系列氢键和疏水相互作用稳定这些分子。在ATP结合的DwCdnB复合物中，发现了两种不同的构象形式（形式1和形式2）。形式1处于预反应状态，准备催化核苷转移反应，而形式2则处于非生产性、底物结合状态。

图1：载脂蛋白和嘌呤核苷酸结合的DwCdnB的晶体结构^[1]

DwCdnB对GTP底物的识别

通过结构精修研究者确定了GTP结合的DwCdnB的高分辨率结构，并观察到该结构中包含两个GTP分子和两个^Mg2+离子。供体和受体GTP分子通过与DwCdnB中特定氨基酸残基的氢键和配位相互作用而稳定。特别是，Mg-A离子和Mg-B离子的配位模式表明GTP结合的DwCdnB处于催化反应的预反应状态。此外，LC-MS/MS分析结果支持了DwCdnB能够利用GTP作为底物合成环二鸟苷酸的功能。

DwCap5被3',3'-环二AMP强烈激活

通过体外实验和晶体结构解析，研究者深入探讨了荒漠芽孢杆菌CBASS抗噬菌体系统效应蛋白DwCap5的分子机制。实验结果表明，DwCap5的DNA酶活性可被特定的CDNs激活，其中3',3'-cAA具有最强的激活效果。晶体结构分析揭示了DwCap5_SAVED结构域的结构特征，并发现其与已知Cap5蛋白的SAVED结构域具有高度的结构同源性。通过比较结构分析，研究者发现了影响DwCap5配体特异性的关键氨基酸残基变化，这为理解DwCap5的配体偏好提供了结构基础。

结论

本研究从耐辐射的荒漠芽孢杆菌（Deinococcus wulumuqiensis）中鉴定出了首个能够识别并合成多种环二核苷酸的细菌环二核苷酸转移酶DwCdnB，并揭示了其底物混杂性的结构基础。同时，此项研究还解释了为何CBASS效应蛋白DwCap5无法区分鸟嘌呤和腺嘌呤。基于这些发现，研究人员提出了一个模型来解释荒漠芽孢杆菌CBASS如何通过产生多样化的核苷酸第二信使来激活下游效应蛋白，从而实现抗噬菌体免疫。这些发现不仅加深了我们对极端微生物免疫机制的理解，还为生物技术和治疗应用提供了新的思路。

参考文献：

1.       Yang CS, Shie MY, Huang SW, Wang YC, Hou MH, Chen CJ, Chen Y. Structural insights into signaling promiscuity of the CBASS anti-phage defense system from a radiation-resistant bacterium. Int J Biol Macromol. 2025 Jan 4:139534. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2025.139534. Epub ahead of print. PMID: 39761885.