沙门氏菌作为一种广泛存在的食源性疾病病原体，对家禽养殖、人类健康及食品安全构成重大挑战。据统计，全球每年约有9380万例胃肠炎病例由沙门氏菌感染所致，不幸导致约15.5万人死亡。在众多血清型中，沙门氏菌肠炎血清型（Salmonella enterica serovar Enteritidis）和鼠伤寒沙门氏菌血清型（Salmonella enterica serovar Typhimurium）因其强大的宿主适应性，被公认为与人类疾病关联最为密切的两种血清型。2022年欧盟报告显示，在27个成员国中报告了65208例人类沙门氏菌感染病例，相当于每10万人中有15.3例病例。鉴于沙门氏菌感染的严重性，准确检测食物和临床样本中的沙门氏菌对于感染的预防和控制至关重要。

然而，传统的检测方法，包括基于培养的方法和PCR，不仅消耗大量时间和资源，而且可能还需要专门的设备和受过训练的人员。因此，快速、敏感和特异性的沙门氏菌检测方法的发展变得尤为重要。

噬菌体，作为细菌的特异性病毒，具有高度的宿主特异性。这一特性使得它们在细菌检测领域得到了广泛的应用。噬菌体的受体结合蛋白（receptor-binding protein, RBPs）在识别和结合宿主细菌方面发挥着关键作用。近年来，利用包括噬菌体溶菌酶和RBPs噬菌体小分子开发新型细菌检测方法的研究受到了越来越多的关注。与传统的抗体相比，基于噬菌体小分子的检测方法具有以下优势：首先，它们对低浓度细菌的检测具有高灵敏度，确保准确的目标识别；其次，检测过程简单快速，能够及时识别细菌感染；第三，其高特异性减少了来自其他因素的干扰，降低了假阳性的风险；最后，噬菌体小分子成本低廉且易于制备，有利于广泛应用。研究人员尝试将噬菌体小分子与生物和化学材料结合，用于检测各种病原体，如大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌。此外，噬菌体展示技术也被用于融合蛋白质分子，以检测食品中的致病细菌。

为解决上述问题，本研究基于ELISA双抗体夹心法的原理，深入探讨了一种两步策略，用于沙门氏菌的定量检测、纯培养和物种鉴定。首先，鉴定了新型噬菌体PJNS004的RBPs及其受体；随后，利用噬菌体PJNS004的RBPs富集沙门氏菌，并使用标记有eGFP的噬菌体PJNS004 RBPs对富集的细菌进行定量和纯培养分析。这种改进的方法在沙门氏菌肠炎（S. enteritidis）的25个不同来源和21个鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）菌株中表现出高效率的检测性能。此外，它还能检测九种其他不同的沙门氏菌血清型，而对其他细菌无影响。该方法在1 × 10²到1 × 10⁸ CFU/mL的范围内具有10 CFU/mL的检测限，快速结合时间为30分钟。此外，它还能有效检测生菜、鸡胸肉和牛奶和临床样本。重要的是，这种建立的两步方法不仅使得临床样本的定量检测成为可能，还使得病原体的纯培养和进一步的基因组分析成为可能。

 在噬菌体PJNS004中，由ORF33编码的蛋白质具有一个保守的N端结构域氨基酸残基1至约134，属于噬菌体T7尾超家族（pfam03906）（图1B）。为了探究ORF33编码的RBP的性质，进行了系统发育分析。结果显示，PJNS004的RBP在系统发育树中形成了一个独特的分支，表明它可能是一种新型的RBP。为了进一步证实该发现，将ORF33的C端片段（氨基酸残基135至748）与SUMO和eGFP融合，成功表达了一种分子量为103.3 kDa的融合蛋白（图1A-D）。Western印迹分析提供了融合蛋白成功表达的额外证据（图1D）。

图1 两步法检测沙门氏菌的流程示意图。(A)重组蛋白SUMOeGFP-RBP（proSM）构建的示意图。(B)噬菌体PJNS004中ORF33的功能区域分析。(C)噬菌体PJNS004中ORF33的三维结构。(D)纯化重组蛋白proSM的SDS-PAGE和Western blot分析。(E)检测策略采用基于proSM对LPS特异性的两步双抗体夹心ELISA。第一步为磁珠富集法。简言之，磁珠包被proM并通过特异性捕获细菌，优化了磁珠用量（20μL）和捕获时间（15分钟），以确保细菌浓度的有效富集。第二步为荧光检测。荧光探针标记的proSM特异性结合细菌LPS，产生可定量的荧光信号。

 研究人员接下来在荧光显微镜下，重组蛋白proSM被观察到与细菌表面结合（图2）。这为透射显微镜观察结果提供了进一步证据，表明proSM粘附于细菌表面的多糖上（图3A）。

图2 荧光显微镜下观察了沙门氏菌SM07株细胞与纯化的重组蛋白proSM结合情况。当荧光标记特异性结合时，细胞呈绿色（A）。为了形成对比，没有特异性标记结合的细胞保持暗色（B）。比例尺为10μm。

 此外，扫描显微镜显示，与对照组相比，重组蛋白proSM结合时在细菌表面上的粘附有明显的差异（图3B）。为了进一步研究噬菌体PJNS004的受体，在编码宿主细菌LPS、膜蛋白和鞭毛的基因中进行了缺失突变。结果表明，LPS相关基因（如RfaC、RfaD、RfaG、RfaH、RfaI、RfaJ、RfaK、RfaL和RfaQ基因）的缺失阻止了噬菌体感染细菌。相反，其他基因（如BtuB和FlgK基因）的缺失对噬菌体感染能力没有影响。此外，已证明重组蛋白proSM对宿主沙门氏菌SM07无杀菌活性。这些发现为PJNS004-ORF33编码的RBP特异性识别宿主细菌的LPS提供了强有力的证据。

图3 重组蛋白 proSM 用于识别其宿主细菌的电子显微镜照片。(A) 透射电子显微镜。比例尺 = 200 nm。(B) 扫描电子显微镜。比例尺 = 1 μm。

 为了优化沙门氏菌检测条件，通过测试一系列蛋白质浓度，确定了最佳涂层剂量。结果表明，在80 μg重组蛋白proSM组和60 μg组之间，射频免疫反应率（RFIRR）值存在显著差异（P < 0.001）（图4A）。考虑到蛋白质使用效率，选择了60 μg进行后续实验。此外，评估了应使用的磁珠量。结果指出，与10 μL组相比，使用超过20 μL的磁珠时，RFIRR值存在显著变化（P < 0.001）（图4B）。鉴于实验成本，20 μL的磁珠被选为后续实验的标准体积。在15分钟的捕获期后，上清液中不再可检测到细菌，证实15分钟为最佳免疫捕获时间（图4C）。

鉴于噬菌体PJNS004的受体为LPS，透射电子显微镜显示重组蛋白proSM附着于细菌表面。值得注意的是，该结合过程并未占用proSM上所有结合位点（图3A），这表明引入其他类似结合蛋白在理论上具有可行性。因此，开发了一种用于捕获和定量细菌的两步法流程。如图1所示，磁珠首先被60 μg proM包覆。在15分钟的细菌捕获后，引入60 μg荧光标记的重组蛋白proSM。结果表明，回归方程为y = a + bx + cx²（其中y代表荧光强度值，x代表Log CFU/mL；a、b和c为固定常数；R² = 0.997）（图4D）。检测阈值为67 ± 2.65，检测限为10 CFU/mL（图4D）。重组蛋白proSM在pH 4–11范围内具有pH稳定性，在4–42℃范围内具有温度稳定性。

图4 优化沙门氏菌检测条件。（A）最佳蛋白质涂层浓度。***P < 0.001，n = 3。（B）磁珠体积的影响。***P < 0.001，n = 3。（C）反应时间的影响。n = 3。（D）标准曲线。n = 3。

 为证实该方法的可靠性与检测样本中沙门氏菌的敏感性，评估了两步法在检测沙门氏菌SM07在生菜、鸡胸肉和牛奶模型中的特异性。通过使用已知浓度的沙门氏菌SM07进行回收实验，研究人员观察到的回收率范围在98%到105%之间，所有相对标准偏差的值均保持在8.5%以下（表1）。为了进一步评估该沙门氏菌检测方法在临床样本中的实用性，进行了回收测试，结果显示回收率在85%到115%之间。随后，使用磁珠富集技术分离的菌株进行了进一步的鉴定。在平板培养的单个菌株通过16S rRNA测序进行识别，显示沙门氏菌的阳性率超过96%。这不仅证实了检测方法的可靠性，还强调了其在食品和动物样本中检测沙门氏菌的卓越敏感性和可重复性。

 表1 沙门氏菌SM07在不同样本中通过两步法检测的回收效率

综上所述，本工作发展出了一种高效且高度灵敏的方法，用于细菌的捕获和定量分析。本工作所开发的两步法检测沙门氏菌，表现出高效率，能够识别来自不同来源的25种S. enteritidis菌株、21种S. typhimurium菌株以及九种其他沙门氏菌的其他血清型，同时对其他九种细菌物种不敏感。其检测限在1 × 10²至1 × 10⁸ CFU/mL的范围内为10 CFU/mL，并且具有30分钟的快速结合时间，同时在食品和临床样本中显示出可靠性和敏感性，在两步富集和纯培养识别后，沙门氏菌检测的准确率超过96%。总之，本工作的方法展示出高特异性、可靠性和敏感性，将其定位为食品安全和临床诊断中沙门氏菌检测的宝贵工具。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.144921