不平衡的肠道菌群通过塑造肝脏炎症微环境促进肝细胞癌的发展
转载 发布时间:2022-08-09 浏览次数: 505 来源: 微生态公众号

核心提示:肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡的主要原因,而晚期HCC的治疗选择有限。本研究观察到肠道生态失调会影响抗肿瘤免疫监测并推动肝病向癌症发展。Nlrp6-/-小鼠中失调的微生物群诱导肝单核型髓系抑制性细胞(mMDSC)扩增,并抑制T细胞增殖。这种表型可通过粪便菌群移植传播,经抗生素治疗后可逆转,表明肿瘤微环境具有高度可塑性。


  肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡的主要原因,而晚期HCC的治疗选择有限。本研究观察到肠道生态失调会影响抗肿瘤免疫监测并推动肝病向癌症发展。Nlrp6-/-小鼠中失调的微生物群诱导肝单核型髓系抑制性细胞(mMDSC)扩增,并抑制T细胞增殖。这种表型可通过粪便菌群移植传播,经抗生素治疗后可逆转,表明肿瘤微环境具有高度可塑性。Akkermansia muciniphila的缺失与mMDSC丰度相关,重新引入此菌可恢复肠道屏障功能并降低肝脏炎症和纤维化。肝硬化患者肝组织中细菌丰度增加,可引起明显的转录变化,包括激活纤维-炎症通路以及介导癌症免疫抑制的回路。本研究表明,肠道菌群可重塑肝脏炎症微环境,为癌症预防和治疗开辟了新途径。
       实验设计

  结果

  1、NLRP6缺失促进NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝病进展
       NLRP6炎性小体是肠道中维持宿主-微生物稳态的重要调节因子,为了研究Nlrp6-/-介导的肠道生态失调对脂肪性肝炎进展的影响,我们将NEMOΔhepa与Nlrp6-/-小鼠交配得到NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠。与NEMOΔhepa小鼠相比,52周龄的NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠显示出更高的肿瘤负荷,而且肝脏/体重比也明显增加(图1a-b)。与NEMOΔhepa小鼠相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)、碱性磷酸酶(AP)和胆红素水平升高,肝损伤增加(图1c)。肝切片H&E和CD45免疫组织化学染色显示,NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠显示出明显的免疫细胞浸润(图1d)。天狼星红(SR)染色以及促纤维化基因Tgfβ和Collagen1a1的mRNA表达水平证实肝纤维化(图1d-e)。肝切片染色显示NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠均表现出明显的免疫细胞浸润(图1d)。然而,与NEMOΔhepa小鼠相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中CD11b+细胞数量显著增加(图1f)。相反,当NLRP6缺失时,CD8+ T细胞减少(图1f)。值得注意的是,WT小鼠中NLRP6的缺失不足以导致肝损伤、炎症或纤维化(图1)。

  如前所述,在NEMO缺失的情况下,经典NF-kB通路的激活所导致的肝细胞死亡是由于抗凋亡基因表达缺失。因此,本研究聚焦肝脏炎症如何影响小鼠的细胞死亡和代偿性增殖。虽然肿瘤组织中促炎细胞因子Tnfa、Il6、Il1β以及炎性小体成分Caspase-1和Nlrp3的mRNA表达水平保持不变,但在没有肿瘤的整个肝组织中,髓系CD11b+细胞浸润与促炎细胞因子Tnfa、Tlr4、Il1β、Nlrp3和Ccl5的高表达密切相关(图1g)。先前的研究表明,NLRP6的缺失会导致NLRP327的过度激活。虽然Nlrp3 mRNA表达水平增加,但我们无法在蛋白质水平上证实这一点(补充图1e, f)。此外,Nlrp3基因表达在早期13周时间点没有变化,表明在NLRP6缺失的情况下,Nlrp3炎性小体过表达并不会介导观察到的表型(补充图1g)。52周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的炎症表型与pJNKd的显著激活相关(图1h),这与裂解Caspase3染色和代偿性增殖显示的凋亡性肝细胞死亡增加相关(图1i-j)。综上,这些结果表明NLRP6缺失重塑NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肿瘤微环境的炎症反应,并推动肝脏疾病向纤维化和癌症发展。


  图1. NLRP6缺失促进NEMOΔhepa小鼠肝病进展。a. 52周龄NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏的外观图。b. 对NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中直径大于1cm的肿瘤进行量化。c. 52周龄NEMOΔhepa (n=12)、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-(n=8)小鼠与相应对照组WT(n=6)、Nlrp6-/-(n=6)小鼠血清中ALT和GLDH水平。d. 52周龄WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝切片H&E染色、CD45免疫组织化学(IHC)染色和天狼星红染色代表图片。e. RT-qPCR分析NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠与相应对照组WT、Nlrp6-/-小鼠肝脏中促纤维因子(TGFβ、Col1al)mRNA表达水平。f.NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠与相应对照组WT、Nlrp6-/-小鼠肝脏CD11b和CD8免疫荧光染色图,DAPI用于染细胞核。g. RT-qPCR分析NEMOΔhepa,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠与相应对照组WT,Nlrp6-/-小鼠肝脏中炎性因子(TNFα、IL-1β、Tlr4) mRNA表达水平。h.以JNK、p-JNK和GAPDH为对照的52周龄的各基因型小鼠肝蛋白提取物的免疫印迹分析。i. 每个视野中裂解Caspase 3阳性细胞的组织学定量。j. KI67的IF染色代表性图片。比例尺:100 μm。所有数据均以平均值±标准误差(SEM)表示。

    2Nlrp6缺失与NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠道菌群失调和屏障受损相关
      来自杂合Nlrp6+/-亲代的WT和Nlrp6-/-同窝仔,在断奶后分别在无特定病原体(SPF)条件下至少繁殖3代,以促进Nlrp6-/-小鼠中失调菌群的发展。后续利用这些雄性小鼠研究肠道菌群失调对脂肪性肝炎进展的影响。采用16S rRNA基因扩增子测序分析13周龄和52周龄NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠以及对照组WT和Nlrp6-/-小鼠的盲肠微生物群组成。首先,基于Bray-Curtis差异比较了13周龄和52周龄小鼠之间的β多样性,即小鼠之间肠道菌群组成的差异。为评估基因型(WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-)、饲养笼、NEMO基因型(WT,Nlrp6-/- vs NEMOΔhepa,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-)以及小鼠品系(Nlrp6-/-,NEMOΔhepa/Nlrp6-/- vs WT,NEMOΔhepa)对组间微生物组成差异的相对贡献,我们进行了置换多变量方差分析(ADONIS)。基因型、饲养笼、NEMOΔhepa基因型和小鼠品系解释了13周龄小鼠中微生物群总变异的很大比例(图2a)。这些分析结果也表明了显著的饲养笼效应。将基因型和饲养笼纳入ADONIS分析,基因型仍然可以解释微生物群总变异的很大一部分(R=0.296,p =0.003)。NEMOΔhepa和NEMOfl/fl,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和NEMOfl/fl/Nlrp6-/-同窝小鼠同笼饲养,NEMO条件性缺失以及所导致的脂肪性肝炎对肠道微生物群组成仍有可重复的影响。β多样性分析证实了Nlrp6-/-品系中独特的微生物群,这解释了微生物群总变异的16%(图2a)。

  基于DESeq2和LEfSe进行差异丰度分析,结果显示NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中Muribaculum丰度相对增加,而Verrucomicrobiaceae和Lachnospiraceae中几种菌显著减少(图2b-c)。所有组进行成对比较显示,与WT小鼠相比,Nlrp6-/-小鼠中Roseburia和Lachnospiraceae减少。与WT同窝小鼠相比,NEMOΔhepa中Akkermansia增加,而此菌在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中完全消失。这些细菌在13周龄和52周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中均不存在,可在LEfSe分析中区分NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠(图3c)。接下来,分析了不同基因型小鼠的肠组织切片,以探索菌群变化对肠道功能的影响。A. muciniphila可降解粘蛋白,与粘液层的增厚和肠道屏障的改善有关。因此,我们分析了结肠粘液层,结果显示NLRP6的缺失与结肠粘液层变薄相关,且在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中最为明显。通过对肠道不同部位的紧密连接蛋白ZO-1进行免疫荧光染色,探究肠道屏障功能。与WT小鼠相比,52周龄NEMOΔhepa小鼠的十二指肠、空肠、回肠和结肠中ZO-1的表达降低(图2d)。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中ZO-1进一步减少,在回肠和结肠最为明显。与NEMOΔhepa小鼠相比,52周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的回肠和结肠组织裂解物中闭锁蛋白表达降低(图2e,f)。然而,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠显示出ZO-1进一步减少,这在回肠和结肠中最为明显。与NEMOΔhepa小鼠相比,52周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的回肠和结肠组织裂解物中occludin蛋白表达降低(图2e, f)。有趣的是,TJ屏障的破坏与炎症基因(如Il1β、Il18、Mcp1和Ccl5)的mRNA表达增加以及回肠组织中CD11b+细胞浸润增加有关(图2g)。总之,这些结果显示NLRP6表达缺失所引起的肠道生态失调促使肠道TJ屏障破坏,炎症基因表达增加。


  如前所述,在NEMO缺失的情况下,经典NF-kB通路的激活所导致的肝细胞死亡是由于抗凋亡基因表达缺失。因此,本研究聚焦肝脏炎症如何影响小鼠的细胞死亡和代偿性增殖。虽然肿瘤组织中促炎细胞因子Tnfa、Il6、Il1β以及炎性小体成分Caspase-1和Nlrp3的mRNA表达水平保持不变,但在没有肿瘤的整个肝组织中,髓系CD11b+细胞浸润与促炎细胞因子Tnfa、Tlr4、Il1β、Nlrp3和Ccl5的高表达密切相关(图1g)。先前的研究表明,NLRP6的缺失会导致NLRP327的过度激活。虽然Nlrp3 mRNA表达水平增加,但我们无法在蛋白质水平上证实这一点(补充图1e, f)。此外,Nlrp3基因表达在早期13周时间点没有变化,表明在NLRP6缺失的情况下,Nlrp3炎性小体过表达并不会介导观察到的表型(补充图1g)。52周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的炎症表型与pJNKd的显著激活相关(图1h),这与裂解Caspase3染色和代偿性增殖显示的凋亡性肝细胞死亡增加相关(图1i-j)。综上,这些结果表明NLRP6缺失重塑NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肿瘤微环境的炎症反应,并推动肝脏疾病向纤维化和癌症发展。

  图2. NLRP6缺失导致肠道生态失调和与脂肪性肝炎活性和肿瘤负荷相关的肠道屏障受损。a.16S rRNA基因扩增子测序分析13周龄WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠盲肠菌群组成。b. DESq分析13周龄NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的差异菌群。c. LEFSe分析NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠道菌群。d. NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和相应的对照组WT和Nlrp6-/-小鼠回肠和结肠ZO-1 IF染色的代表性图片。e,f. 免疫印迹分析52周龄小鼠回肠和结肠组织蛋白提取物中Occludin的表达,β-actin作为内参。g. RT-qPCR分析NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠回肠中炎性因子(IL-1β、Il-18、TNFα、Mcp1、Ccl5)的mRNA表达水平。h. 灌胃FITC-葡聚糖评估NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠道通透性。i. FITC-葡聚糖通透性与肠道屏障功能强相关,红点代NEMOΔhepa/Nlrp6-/-,蓝点代表NEMOΔhepa小鼠。

  3、肠道通透性与脂肪性肝炎和增加的肿瘤负荷相关
      接下来,我们研究了NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠道生态失调和肠道屏障损伤对肠道功能的影响。与NEMOΔhepa对照相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠通透性明显增加(图2h)。值得注意的是,ALT水平和肿瘤数量与肠道通透性密切相关(图2i),表明肠道屏障受损加剧NEMOΔhepa小鼠的肝脏疾病。

  4、NLRP6缺失重塑肝脏免疫微环境
      13周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝组织中白细胞浸润增加,SR染色显示肝纤维化加重,Ki67免疫组织化学(IHC)染色表明肝细胞增殖增加(图3a-b)。与NEMOΔhepa小鼠相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的ALT、AST和GLDH水平显著增加,表明肝损伤更为严重(图3c);且NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝脏/体重比显著增加。星状细胞可触发HCC发展过程中的上皮-间质转化。与NEMOΔhepa小鼠相比,aSMA染色显示13周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠星状细胞活化增加。然而,没有证据表明NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中hedgehog信号激活增加(补充图3f)。肠道生态失调和屏障受损促进MAMPs通过门静脉进入肝脏,从而激活由病原体识别受体(PRR)介导的先天免疫反应。与NEMOΔhepa小鼠相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中CD45+白细胞浸润显著增加(图3d-e)。与NEMOΔhepa相比,流式细胞术分析(FACS)显示髓系抑制性细胞(CD45+CD11b+Ly6G-Gr1hi)以及CD11b+Ly6G+细胞浸润显著增加(图3f)。值得一提的是,mMDSC丰度与ALT水平密切相关,表明它们介导NEMOΔhepa小鼠肝损伤(图3g)。mMDSC在肿瘤发展中对T细胞具有明显抑制效应,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中细胞毒性CD8+ T细胞(CD45+CD3+CD8+)和CD4+ T细胞(CD45+CD3+CD4+)明显减少(图3h)。mMDSC丰度与细胞毒性T细胞呈负相关(图3i)。其他免疫细胞亚群,如Kupffer细胞、NK/NKT细胞和B细胞保持不变。此外,在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中观察到M2标志物Arg1表达增加,而M1标志物Nos2表达降低,表明这些小鼠中存在促肿瘤微环境。

  5、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-mMDSCs在体外抑制T细胞增殖

  根据细胞表面标志物表达不能充分定义MDSCs。因此,我们进行了额外的染色和功能分析,以进一步确定细胞表型。CD11b+ mMDSCs和CD8+ T细胞非常接近,在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝脏中最为明显(补充图5a)。接下来,我们分离并进一步表征了这些细胞,并通过体外实验检测它们对T细胞的抑制能力。从WT和Nlrp6-/-小鼠脾脏中分离T细胞,用CFSE标记,CD3/CD28刺激后,与NEMOΔhepa或NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中分离的粒细胞MDSC(CD45+Ly6G+Gr1hi)或mMDSC(CD45+Ly6G-Gr1hi)共培养,结果显示mMDSCs明显抑制CD8+ T细胞增殖,且在与NEMOΔhepa/Nlrp6-/- mMDSCs共培养时抑制效应最明显(图3i)。这些结果说明,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠道生态失调与mMDSCs扩增密切相关,同时与NEMOΔhepa mMDSCs相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-mMDSCs具有更强的抑制效应。


  图3. mMDSCs促进NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠脂肪性肝炎进展。a. 13周龄WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝切片KI67免疫组织化学染色和HE染色代表性图片。比例尺:100 μm。b. 每个视野中Ki67+细胞的组织学定量。c. 13周龄NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和相应的对照组WT、Nlrp6-/-小鼠血清中ALT和GLDH水平。d,e. 13周龄小鼠CD45肝切片免疫组化代表性图片(d)及定量分析(e)。f. 流式细胞术分析各基因型13周龄小鼠(NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和对照WT、Nlrp6-/-)肝脏中单核细胞骨髓源性抑制细胞(mMDSC)。g. NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中,CD45+活细胞中mMDSCs的比例与ALT水平密切相关。h.流式细胞术分析各基因型13周龄小鼠(NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和对照WT、Nlrp6-/-)肝脏中CD3+CD8+细胞毒性T细胞的比例。i. CD45+活细胞和CD8+细胞毒性T细胞的mMDSCs百分比呈负相关。j. 体外T细胞增殖实验。T细胞与粒细胞MDSCs或单核MDSCs共培养。

  6、微生物减少重塑肝脏炎症微环境并改善脂肪性肝炎
      为探究肠道微生物群是否影响NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中炎症反应,我们利用广谱抗生素(ABx)组合处理8周龄小鼠直至第13周。抗生素处理导致肠道菌群几乎完全清除。值得注意的是,ABx处理后NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝转氨酶水平与NEMOΔhepa小鼠相似,并且与未处理小鼠相比显著降低(图4a)。重要的是,ABx处理导致mMDSC显著降低,FACS证明了这一点,同时也反映在IF染色中CD11b+细胞的数量减少(图4b,c)。相反,ABx处理导致CD8+ T细胞和CD4+ T细胞扩增,几乎达到NEMOΔhepa小鼠肝脏中的水平(图4b)。

  7、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的免疫表型可通过FMT传递到NEMOΔhepa小鼠并涉及TLR4信号
      在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中,ABx清除肠道菌群可改善肝损伤、抑制mMDSC浸润并恢复细胞毒性T细胞丰度(图4b)。为了进一步探究Nlrp6-/-小鼠肠道菌群的致病性,我们将NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠粪便菌群移植(FMT)到NEMOΔhepa小鼠。微生物群转移导致NEMOΔhepa肠道菌群沿NMDS轴1移动。DESeq2和LEfSe分析比较了进行/不进行FMT的NEMOΔhepa小鼠菌群组成,表明这种转变主要由A. muciniphila的差异丰度导致(图4d)。值得注意的是,在FMT中,所有受体NEMOΔhepa小鼠均缺乏A. muciniphila,在比较NEMOΔhepa FMT-受体与NEMOΔhepa/Nlrp6-/- FMT-供体的LEfSe分析中,只观察到一个差异OTU (OTU23_ambiguous_taxa),进一步支持了成功的微生物转移。FMT导致NEMOΔhepa小鼠的肝转氨酶AST和ALT显著增加(图4e)。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠微生物的FMT导致受体NEMOΔhepa小鼠肝脏中CD45+白细胞的绝对数量增加,mMDSC显著扩增,并有效抑制细胞毒性T细胞(图4f-h)。

  由于NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肠道生态失调会损害肠道屏障功能,从而促进PRRs的激活,我们测试了TLR4是否参与FMT介导的mMDSCs增殖。利用NEMOΔhepa/Tlr4-/-作为受体小鼠,将NNEMOΔhepa或NEMOΔhepa/Nlrp6-/-肠道菌群转移到同窝受体小鼠中。与移植NEMOΔhepa肠道菌群相比,移植NEMOΔhepa/Nlrp6-/-肠道菌群的NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠,其肝损伤并未增加,血清AST和ALT水平以及mMDSC丰度保持不变(图4i-j)。与TLR4参与mMDSC扩增一致,8周龄和52周龄的NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠mMDSC丰度降低。这一观察结果也与肝转氨酶水平降低、细胞死亡和增殖减少以及52周龄小鼠的肿瘤负荷降低相关。此外,mMDSC丰度降低与CD3+CD4+ T细胞增加有关。为了确定这种免疫表型是由造血细胞还是实质细胞介导,我们进行了骨髓移植实验。与接受WT骨髓的NEMOΔhepa小鼠相比,接受Tlr4-/-供体骨髓的嵌合小鼠显示出mMDSC丰度显著降低了6倍以上,表明造血细胞中TLR4参与上述免疫表型调控。总之,这些数据表明NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的免疫表型可经FMT传递给NEMOΔhepa小鼠。确切地说,造血细胞中的TLR4信号增强了mMDSC浸润并促进脂肪性肝炎向HCC发展。


  图4. 肠道菌群重塑NEMOΔhepa小鼠肝脏免疫微环境。a.从第8周起至第13周,用抗生素处理NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠,分析小鼠血清AST和ALT水平。b.流式细胞术分析经/未经ABX处理NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中mMDSC细胞与CD3+CD8+ T细胞。c. 经/未经ABX处理的NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠CD11b免疫荧光染色代表性图片。d. DESeq分析13周龄NEMOΔhepa和NEMOΔhepa-FMT小鼠微生物群差异丰度。e. NEMOΔhepa小鼠(有/没有移植NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠道菌群)血清中AST水平。f. 有/没有FMT的NEMOΔhepa小鼠中CD11b的免疫荧光染色。g.h. 流式细胞术分析有/没有FMT的NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中mMDSC细胞和CD3+CD8+细胞毒性T细胞。i-j. 流式细胞术分析NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠道菌群的NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠血清中ALT和AST水平(i)和肝脏中mMDSC细胞(j)。

  8、NEMOΔhepa小鼠肠道菌群的特定改变与肝病表型相关

  13周龄和52周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肠道微生物群与NEMOΔhepa小鼠明显不同。肠道菌群可重塑肝脏炎症微环境。因此,我们探究哪些微生物群的特定变化可能影响NEMOΔhepa小鼠的肝病。LEfSe分析显示,与NEMOΔhepa小鼠相比,A. muciniphila在13周和52周龄的NEMOΔhepa/Nlrp6-/-以及接受FMT的NEMOΔhepa小鼠中显著减少(图2b)。此外,在NEMOΔhepa小鼠中,A. muciniphila的相对丰度与肝脏mMDSC丰度以及血清ALT和GLDH水平呈负相关,表明这些细菌在介导表型中的相关性(图5a)。因此,我们在NEMOΔhepa小鼠中验证A. muciniphila移植是否可以改善肝脏疾病。用2×108CFU的A. muciniphila或厌氧PBS对8周的NEMOΔhepa同窝小鼠进行口服灌胃,每周3次,持续5周(图5b)。通过对灌胃5周前后的粪便样本进行RT-qPCR和16S rRNA基因扩增子测序,证实了成功的微生物群移植(图5c)。PCA分析显示,AKK处理不仅增加了这种特定细菌的丰度,而且导致微生物群组成发生显著变化(图5c)。A. muciniphila处理解释了在这些小鼠中观察到的微生物群总变异的很大比例。LEfSe分析显示拟杆菌门减少,Akkermansia增加(图5d)。DESeq2分析显示,补充Akkermansia还导致Lachospiraceae和Blautia丰度增加,这与微生物群整体丰度的增加有关。与PBS处理的对照小鼠相比,经A. muciniphila灌胃的NEMOΔhepa小鼠的结肠粘液层明显增厚且ZO-1表达增加。结肠组织裂解物的蛋白质印迹分析显示,A. muciniphila灌胃后,Occludin蛋白水平显著增加(图5g)。与PBS对照相比,经A. muciniphila灌胃的NEMOΔhepa小鼠中,肝损伤标志物(即ALT、AST、LDH和GLDH)的血清水平明显降低(图5h)。CD45和CD11b染色显示,A. muciniphila处理导致肝纤维化和白细胞浸润显著减少(图5i)。与此一致,A. muciniphila灌胃的NEMOΔhepa小鼠中纤维炎症基因的mRNA表达显著降低(图5j)。最后,我们探究在Nlrp6-/-生态失调模型中是否可以改善肝脏疾病的进展。与PBS处理的NEMOΔhepa小鼠相比,A. muciniphila处理可降低NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝损伤,这与骨髓CD11b+细胞浸润显著减少和SR染色证明的肝纤维化降低有关。这些数据共同表明,即使存在促进生态失调的宿主因素(如NLRP6缺失),持续补充A. muciniphila也可以减少肝损伤、炎症和纤维化。


  图5. 补充A. muciniphila可改善NEMOΔhepa小鼠的肝脏疾病。a. NEMOΔhepa小鼠盲肠A. muciniphila的相对丰度与mMDSCs的相关性分析。b. 实验流程,8周龄的NEMOΔhepa小鼠连续5周灌胃2.1×108 CFU AKK或厌氧PBS。c.d. PCoA分析(c)和LEFSe分析(d) NEMOΔhepa小鼠AKK处理前后的微生物群。e.f. AKK或PBS处理NEMOΔhepa小鼠结肠MUC2免疫荧光染色(e)和回肠、结肠ZO-1免疫荧光染色(f)的代表性图片。免疫印迹分析NEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS 5周后结肠蛋白提取物中occludin蛋白表达,β-actin作为内参。h. NEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS 5周后血清中ALT和AST水平,非配对t检验。i. NNEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS后H&E染色的肝切片和CD11b免疫荧光染色的代表性图片。j. RT-qPCR分析NNEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS 5周后肝脏组织中炎症因子和促纤维化因子(TGFβ、Col1a1、Mcp-1、Tlr4)的mRNA表达水平。

  9、肝硬化患者的细菌易位较高,影响肝脏转录谱
      接下来,我们探究在小鼠中观察到的结果是否也适用于人类。因此,我们从接受肝移植的晚期混合病因肝硬化患者(n=43)和接受其他腹部手术的对照组患者(n=12)中收集速冻肝组织。利用16S rRNA基因扩增子测序分析肝脏细菌DNA丰度。同时通过mRNA测序研究宿主基因表达,以评估细菌易位如何影响肝脏转录谱。RT-qPCR检测显示,与对照组相比,肝硬化患者每纳克总DNA中具有更高的16S rRNA基因拷贝(图6b)。肝硬化患者表现出更高的α多样性(Shannon指数)。NMDS排序显示肝硬化患者与对照组之间存在中度聚类(补充图9b)(R2= 0.038, p = 0.01, ADONIS),并且在LEfSe分析中,Stenotrophomonas、Roseburia、Sphingobiom以及Psychrobacter将肝硬化患者与对照区分开。乳杆菌目与患者的MELD评分和胆红素水平呈负相关(补充表3)。转录组数据的PCA分析显示肝硬化患者和对照的明显聚类。基于PROGENy的通路分析发现,与对照组相比,肝硬化患者中纤维炎症通路TGFβ、NFκB、TNFα和缺氧以及与肝损伤修复、再生和恶性转化相关的通路(如EGFR、MAPK、P53、PI3K和WNT)显著上调(图6c)。MAPK和TGFβ信号通路的激活与肝脏中16S rDNA丰度相关(图6c)。此外,梭菌属丰度与MAPK、EGFR、TNFa和NFκB通路激活相关。基于DoRothEA推测的几种致癌转录因子(如FOS、ETS2、RELB、SOX10、ERG、WT1和JUND)以及干性转录因子(如PBPJ和ARID3A)在肝硬化患者中上调并与细菌易位相关。此外,癌症相关基因也与16S rRNA基因丰度相关。

  10、细菌易位塑造炎症微环境并促进肝硬化中T细胞耗竭标志物的表达
      基于小鼠数据,我们下一步专门研究了细菌易位对人类肝硬化肝脏炎症环境的影响。为此,利用xCell对肝细胞基因表达谱分析,肝硬化表现出整体免疫细胞和基质细胞的富集,而肝细胞评分相对降低(图6d)。有趣的是,16Sr RNA基因丰度升高与CD8+ T细胞、NKT细胞、CD4+中央记忆性T细胞和调节性T细胞增加有关,后者与肿瘤免疫抑制相关(图6d)。包括编码PD-1的PDCD1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA4)在内的几个免疫检查点基因显示出与16S rRNA丰度的强相关性(图6e,f)。与这些研究结果一致,胸腺细胞选择相关基因TOX、IRF4以及REL和BACH2(指导人类癌症中的T细胞耗竭和免疫抑制)与16S rRNA 基因丰度高度相关(图6g)。相反,与T细胞活化状态相关的TOX3转录因子表达和活性是与16S rDNA丰度负相关最强的5个转录因子之一。暴露于MAMPs和PAMPs时,先天免疫反应的激活依赖于通过PRRs感知。几种PRRs(如NOD1、NLRP3和TLR2)的表达均与细菌易位相关。MDSCs是MAMPs和PAMP的重要传感器,可能抑制T细胞功能。MDSC标记集落刺激因子受体2a(CSFR2A)和白细胞介素1受体2(IL1R2)的表达水平均与16S rRNA基因丰度密切相关。总之,这些数据表明,肝硬化患者的细菌易位与纤维炎症通路以及与免疫抑制和T细胞耗竭相关的转录因子激活密切相关。


  图6. 肝硬化患者细菌16S rDNA增加并改变肝脏转录谱。a.研究流程:速冻手术肝组织标本取自44名接受肝移植的肝硬化患者或11名健康对照者。从同一组织标本和组织区域分离DNA和mRNA,并进行16S rRNA基因扩增子测序或mRNA测序。b. RT-qPCR分析对照(n = 12)和肝硬化患者(n = 43)患者每纳克DNA中16S rRNA基因拷贝数。c.基于mRNA测序数据和PROGENy推测健康对照和肝硬化患者的信号通路分析。d.健康对照和肝硬化患者中细胞类型富集,以及与16S rRNA基因相对丰度的相关性分析。e.16S rRNA基因丰度与免疫检查点基因的表达密切相关。f-g. 每纳克基因组DNA中rRNA基因拷贝与CTLA4和T细胞耗竭相关转录因子(TOX,IRF4)表达的相关性。

  讨论

  肠-肝轴和肠道菌群是慢性肝病研究的热点,也是进行慢性肝病发病机制探究的基石。本研究认为肠道屏障损伤和细菌易位是重塑肝脏炎症微环境和促进肝脏疾病向肝硬化和HCC发展的关键机制。慢性疾病、与现代西方生活方式相关的环境和饮食因素以及药物治疗已被发现有助于肠道生态失调。这些因素改变肠道菌群构成,并直接影响机体炎症状态。由于肝脏通过门静脉不断地暴露于来自肠道的大量微生物衍生物,肠道稳态的变化影响肝脏的生理机能。
      小鼠模型是进行肠-肝轴机制研究的有效工具。NLRP6炎性小体是肠道中维持宿主-微生物稳态的重要调节因子,而NEMOΔhepa小鼠是自发性脂肪性肝炎、肝纤维化小鼠模型,最终可发展为肝细胞癌。因此,本研究利用NLRP6缺失的NEMOΔhepa小鼠(即NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠)进行慢性肝病的机制探索。有趣的是,NEMOΔhepa小鼠的微生物群不同于WT小鼠,并且NEMOΔhepa小鼠肠屏障受损。肝脏中NEMO缺失损害肠道屏障的机制值得未来进一步探究,这可能受胆汁酸成分的变化或系统性炎症失调的影响。NLRP6 NEMO其他IKK组分的缺失在人类HCC中尚未被报道,本研究所利用的小鼠模型很好地反映了人类肝脏疾病进展的基本机制,为探究NLRP6缺失所引起的肠道生态失调对肝脏疾病进展的影响提供有力的工具。本研究显示NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肠道菌群变化可转化为与脂肪性肝炎活动性标志物以及肿瘤负荷密切相关的肠道屏障功能受损。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的微生物群与NEMOΔhepa小鼠存在显著差异。NLRP6缺失与致病菌Muribaculum丰度增加相关,而A. muciniphila缺失。几项人类和小鼠研究表明,A. muciniphila通过改善肠屏障功能有益宿主健康。有趣的是,有研究指出在早期HCC患者中发现A. muciniphila缺失。
       为了探究观察到的表型变化是否是由改变的肠道菌群介导,我们进行了肠道菌群调节实验。有趣的是,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的表型可通过粪便移植(FMT)传播,并在Abx治疗时可逆。NEMOΔhepa小鼠NLRP6缺失或者将NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肠道菌群移植到NEMOΔhepa小鼠中引发了明显的肝髓系细胞浸润(定义为CD11b+Ly6G+Gr1hi)。根据表面标志物的表达并在体外证实其对T细胞增殖的抑制效应后,将这些细胞称为mMDSCs。这些动态变化与T细胞丰度减少有关,表明与肠道菌群相关的肝脏炎症微环境具有高度的细胞可塑性。既往研究报道了CD8+ T细胞在HCC中的抗肿瘤活性,但这取决于它们的表型和组织微环境。它们还可能促进肝损伤并向HCC发展。未来CD8+ T细胞耗竭实验可能有助于在该模型中建立因果关系。既往报道认为肝癌发展过程中Kupffer细胞和巨噬细胞会发生表型变化并形成促肿瘤微环境。本研究没有观察到Kupffer细胞丰度的变化,肝脏基因表达分析显示存在促进M2型巨噬细胞极化的微环境。调节性T细胞可以在肠道中进行重编程,并可能在肝脏中发挥其免疫抑制功能。虽然这不是本研究的重点,但未来对该机制的研究可加深对HCC发展过程中肠道介导的免疫调控的理解。我们假设PRR信号尤其是TLR4可能是这种应答的重要协调者,本研究发现52周龄NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠的MDSCs明显降低,CD4+T细胞增加,这与肿瘤负荷的降低密切相关。此外,将NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的失调肠道菌群移植到NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠中并未能促进mMDSCs扩增。这与之前的研究一致,即TLR4介导的PRR信号参与MDSC增殖。但我们不能排除其他PRRs或者菌群依赖的方式所形成的信号回路对肝硬化中炎症反应的调控。几乎所有HCC病例都发生在肝硬化的背景下,由先天和适应性免疫反应介导的慢性炎症驱动疾病进展。T细胞和B细胞的免疫监视也可以限制肝癌的发生。因此,T细胞和MDSCs之间的相互作用至关重要,因为MDSCs积累可导致T细胞衰竭,从而促进HCC的进展。总之,免疫调控在肝病恶性转化的过程中至关重要,探索其中的分子机制可为疾病治疗提供新的途径。肠道菌群可以通过MAMPs、微生物代谢物、胆汁酸以及短链脂肪酸等多种方式调控肝脏免疫反应。
      在患者中,评估肠道屏障功能、细菌易位及其对肝脏的影响具有挑战性,因为缺乏良好的非侵入性血清标志物来检测屏障功能受损和肝脏炎症。虽然一系列研究已将肠道菌群的变化和宏基因组分析与临床和组织病理学肝硬化表型联系起来,但尚不清楚这些变化是否直接影响肝脏炎症反应或肝脏转录组。基于本研究的小鼠模型,我们假设细菌易位可能影响晚期肝硬化患者的肝脏炎症微环境。因此,本研究通过对肝组织16S rRNA分析评估细菌易位,量化总细菌DNA含量,进行16S rRNA基因扩增子测序并将这些数据与来自同一组织样本的转录组数据相关联。根据本研究的小鼠数据,细菌易位与人类肝硬化中的纤维-炎症转录通路密切相关,表明细菌易位是肝病进展的驱动因素。本研究NEMOΔhepa小鼠的数据与一项临床研究一致,与健康对照组相比,肝硬化患者肠道炎症(钙卫蛋白)以及通透性(ZO-1和LPS)的血清标志物增加。有趣的是,与对照组相比,NAFLD肝硬化患者屏障功能受损与Akkermansia丰度降低以及循环mMDSCs降低相关。此外,我们发现短期调节NEMOΔhepa小鼠的肠道菌群,可引起mMDSC和T细胞丰度的显著变化。补充单一细菌Akkermansia muciniphila可改善肠道屏障功能,减少MDSCs的浸润并抑制脂肪性肝炎活动。总之,这些数据需要进一步研究以评估在HCC患者中补充Akkermansia的治疗效果。理想的研究将涉及肝脏活检和菌群样本的收集,这将建立起肠道菌群与肝脏16S rRNA基因丰度和肝脏转录谱的相关性。
      最近的一项临床试验显示,连续3个月每天补充A. muciniphila具有良好的耐受性,改善了肥胖性胰岛素抵抗受试者的胰岛素敏感性和血脂状况。与本研究的小鼠数据类似,调节肠道菌群有可能重塑HCC患者的肝脏炎症环境,这一假设也受到一系列强调肠道菌群在免疫检查点治疗中的作用的研究的启发。最近的研究将Akkermansia的丰度与良好的治疗效果联系起来,但在治疗前摄入广谱抗生素会导致肠道生态失调,从而损害治疗反应。尽管研究的肝硬化组织可能无法具体反映HCC微环境,但观察到的肝脏16S rRNA丰度与纤维-炎症通路的表达、癌症免疫抑制基因以及MDSCs、T细胞耗竭和PRR信号通路等与HCC疾病进展密切相关。推测肝脏16S rRNA基因丰度可作为肠道屏障受损和生态失调的生物标志物,有助于预测对免疫疗法的治疗反应,并识别可能受益于菌群调节治疗的患者。基于PCR的检测可以在标准的临床活检工作流程中轻松实施。本研究的局限性是功能微生物群调节研究仅在小鼠中进行,还需要在临床上进行大规模研究。基于本研究的肠道菌群分析以及其他关于A. muciniphila和肠道稳态的研究,我们将功能实验集中在这种共生菌上。本研究发现NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中Blautia的丰度也有所降低。既往研究认为Blautia可产生短链脂肪酸,进而发挥抗炎效应。Blautia或其他共生菌株也可能具有保护作用。未来的研究可以探索Blautia在HCC发生发展中的作用。最后,使用无菌小鼠进行的菌群调节实验将提高实验的准确性,以此来探究Nlrp6-/-小鼠肠道菌群的转移是否导致HCC发展将会很有趣。本研究中RNA测序数据将细菌易位与纤维-炎症通路以及参与T细胞衰竭的TF表达联系起来。但未来研究需要涉及蛋白质和组织学数据以进一步证实这些发现。

  结论

  综上,本研究基于小鼠模型和人类临床研究数据,表明肠道菌群直接影响肝脏炎症微环境。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的失调不良菌群可传播至NEMOΔhepa小鼠,通过促进mMDSCs和抑制CD8+ T细胞加剧肝脏疾病进展。重要的是,通过调控肠道菌群重塑炎症微环境,为微生物群靶向治疗提供了合理的依据。肝硬化患者的肝组织微生物群与肝转录组特征的关联仍需要大规模的研究来评估其诊断应用。

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