益生菌的摄入影响了人类和小鼠肠道微生物群的普遍适应性突变

  摘要

  宿主原生肠道微生物中的益生菌的适应性进化对益生菌的安全性和有效性评价至关重要，但这一领域的研究还远远不够。在这里，通过11个公开可访问的数据集，作者证明了益生菌的摄入可以导致原生菌群中广泛的单核苷酸变异(SNVs)。有趣的是，同样的益生菌菌株在小鼠肠道中引入的SNV比人类多得多。通过交叉研究，在Faecalibacterium prausnitzii基因组中发现了17个常见的SNVs，这些SNVs可能导致细菌蛋白质结构的改变。此外，在一个独立的人类队列中，近50%的普氏F. prausnitzii SNV可以遗传6个月，而另一半只短暂发生。总的来说，作者的研究极大地扩展了我们对益生菌和本土肠道菌群共同进化的理解，强调了以综合方式评估益生菌有效性和安全性的重要性。

  结果

  1.摄入益生菌通常会改变肠道微生物的遗传组成。

  除了含有植物乳杆菌 HNU082(植物乳杆菌 HNU082)的小鼠外，在使用 Probio-Fit、鼠李糖乳杆菌 GG(鼠李糖乳杆菌 GG)和双歧杆菌 HN019 进行饮食干预后，宿主中出现SNV 的肠道微生物物种数量显着减少。具体来说，在人类和小鼠群体中，SNV的原始频率与测序深度正相关(图1b和补充图1)。益生菌L. plantarum HNU082、L. rhamnosus GG和乳酸双歧杆菌HN019的摄入显著降低了肠道居民的SNVs (nSNVs)总频率。总的来说，这表明益生菌的摄入可以显著改变广泛的本地肠道菌群的遗传组成，而这往往是人们没有想到的。

  2.食用益生菌引起的nSNVs具有菌株特异性。

  益生菌诱导的SNV总体格局对益生菌菌株具有高度的特异性。此外，nSNVs与益生菌剂量、益生菌持续时间等实验因素之间没有显著相关性(图2e)。nSNVs与肠道菌群β多样性的相关性模式对所摄入的益生菌菌株具有高度特异性(图2f)。发现由长双歧杆菌 AH1206 和植物乳杆菌 HNU082 消耗引起的 nSNV 与基线和益生菌干预后肠道微生物群的 Bray-Curtis 距离呈正相关(长双歧杆菌 AH1206，R = 0.43;植物乳杆菌 HNU082， R=0.607)，而 L. rhamnosus GG 和 L. casei Zhang 呈负相关(L. rhamnosus GG，R= -0.346;L. casei Zhang，R = -0.367)。混合益生菌引起的nSNV与肠道菌群的Bray - Curtis距离无相关性。这表明益生菌诱导的nSNV总体模式具有高度的益生菌菌株特异性。

  3.在益生菌干预下，宿主肠道微生物的普遍适应性突变。

  益生菌干预并未显着改变所有这三个物种的相对丰度，虽然肠道微生物组的生态改变有限，但益生菌的干预导致这些肠道居民个体的遗传组成，这表明在选择压力下，微生物群落的进化反应可能先于生态变化。值得注意的是，在独立研究中，F. prausnitzii ATCC 27768共享的SNVs最多(N =19)(补充数据4)，而直肠Eubacterium和Roseburia testinalis也分别有两个共享的SNVs。接下来，我们验证了这些通过益生菌干预产生的候选适应性SNV是否也能在对照组中出现(null模型，补充数据5)。在对照组中也检测到益生菌组的两株F. prausnitzii的SNVs。因此，我们确定了总共有17个SNVs发生在特别适应益生菌摄入的F.prausnitzii中，并且可以在不同的宿主队列中验证(图4a)。

  4.益生菌干预诱导的 F. prausnitzii SNV 相关基因的功能注释。

  在17个因益生菌消耗而产生的适应性SNAs中，13个(76.5%)发生在功能基因的基因编码区。7例为非同义突变，6例为同义突变。这些突变涉及9种功能蛋白，包括30S核糖体蛋白S5、磷酸水解酶、感知组氨酸激酶KdpD、铁蛋白、fprA家族a型黄蛋白、硝基还原酶家族蛋白、核糖核酸-二磷酸还原酶亚单位β、肽酶S24和II型toxin-antitoxin系统PemK / MazF家庭毒素(图4和表3),包括四种类型的突变> G (n = 6), > C (n = 6), G > (n = 3)和G > T (n = 2)(图4 b和表3)。已知6个蛋白表达基因含有非同义突变。接下来，利用Phyre2预测摄入益生菌前后的蛋白结构，并通过EZMOL进一步观察这些非同义基因突变如何显著改变蛋白结构。硝基还原酶家族蛋白和fprA家族a型黄酮类蛋白的预测结构已被大幅修改(图4c)，表明益生菌暴露后肠道菌群的功能潜能发生了显著变化。其他蛋白质的结构和氨基酸序列已在补充图2中提供。

  此外，益生菌长双歧杆菌AH1206、植物乳杆菌HNU082和干酪乳杆菌张组中硝基还原酶家族蛋白的dN/dS比>1。在植物乳杆菌HNU082和混合益生菌(Probio-Fit)处理期间，磷酸水解酶均被阳性筛选。此外，混合益生菌(ProbioFit)和单菌株益生菌(L. plantarum HNU082)在肽酶S24和II型毒素-抗毒素系统PemK/MazF家族毒素中也表现出相同的dN/dS比例。尽管如此，不同的益生菌产品仍可能对肠道居民的微生物功能基因有不同的进化影响模式。在益生菌L. plantarum HNU082的干预下，铁蛋白和fprA家族a型黄酮类蛋白的dN/dS比值为>1，而混合菌株的干预则相反。值得注意的是，只有传感器组氨酸激酶KdpD基因进行了纯化选择(dN/dS < 0.25)。这表明，由于摄入益生菌形成了新的肠道环境，普雷沃氏菌的大多数基因趋于中性。上述结果表明，在不同益生菌干预的环境压力下，肠道菌群发生了明显的进化变化。

  5.益生菌干预诱导的适应性 SNV 的遗传能力。

  研究表明，益生菌的干预导致了肠道居民长期但经常被忽视的基因变化。在观察到的293个可遗传SNV和317个瞬时SNV中，鉴定了129个功能基因。在129个功能基因中，39个独特地来自可遗传的SNV，43个独特地来自瞬时SNV，47个重叠(图5c和补充数据6)。

  接下来，分析了完全遗传或瞬时SNV的功能基因，这些SNV是由益生菌干预从I期到II期诱导的。首先鉴定出16个完全SNV遗传的蛋白(图5d)，它们在I期和II期都包含至少两个一致的SNV。接下来，对20个蛋白产品进行了功能性注释，这些蛋白产品在I期至少有两个瞬时SNV，而这两个SNV在II期无法检测到(图5e和补充数据6)。例如，这些完全SNV遗传的蛋白之一，FprA家族a型黄酮类蛋白，具有10个由益生菌HNU082诱导的SNV，可以在非常长的一段时间内遗传。有趣的是，大多数瞬时SNV相关蛋白都参与碳水化合物转运和代谢，例如碳水化合物ABC转运蛋白通透酶、碳水化合物ABC转运蛋白底物结合蛋白和碳水化合物结合蛋白。这表明肠道微生物群落中的居民倾向于适应性地进化碳水化合物相关蛋白，以应对短期的益生菌入侵。

  图解

  图1：由于益生菌的干预而导致的天然肠道菌群遗传多样性的改变。(a) barplot表示摄入益生菌后肠道内存在SNVs的物种数量。条形表示具有snv的物种数量。(b)散点图显示了SNVs的原始数量与目标基因组测序深度的相关性。绿色代表小鼠(R= 0.66, P=0.003)，橙色代表人类队列(R=0.69, P< 0.001)。(c) barplot表示两个时间点(每项研究益生菌干预的基线和终点)的SNVs归一化数。所有的误差条代表SEM。图形的源数据可用作补充数据7或FigShare。

  图2：益生菌诱导的进化变化及其与实验因素的关联。(a)散点图显示了所有纳入研究的益生菌干预诱导的SNV归一化数量(即目标基因组的SNV数量/测序深度)。虚线连接动物实验和人类队列中相同的益生菌菌株。蓝色阴影表示益生菌产生的nSNVs与对照组(NT-HNU082和NT-Supherb Bio-25)的比较。(b, c)在人类队列中，基于摄入益生菌诱导的SNV在物种水平谱计算alpha多样性指数(Shannon和Simpson指数)(P< 0.001)。阴影部分表示变量的全部概率分布。(d)在人类队列中，研究内部和研究之间的遗传多样性差异是根据天然肠道微生物群的物种水平SNV谱估计的。(e)持续时间(R=0.134, P=0.205)和益生菌剂量(R=−0.112,P=0.289)与益生菌诱导的SNV归一化数无显著相关性。(f)微生物物种丰度谱的Bray - Curtis距离与益生菌诱导的snv归一化数之间的研究依赖相关性，包括阳性(AH1206和HNU082)、阴性(LGG和Zhang)和不相关(混合益生菌)。图形的源数据可用作补充数据7或FigShare。

  图3：在多项研究中，将益生菌干预下三种关键肠道生物的生态和进化变化联系起来。箱形图显示了(a) F.prausnitzii、(b) Eubacterium rectale、(c) Roseburia intestinalis在不同时间点间的相对丰度和SNVs归一化数。采用Wilcoxon秩和检验比较时间点间的丰度或nSNVs，并考虑在0.05水平上的显著性。对于每次比较，T0代表基线阶段，T1代表干预阶段的终点(时间变量)。方框代表第 25-75 个百分位数，whiskers代表整个范围，线代表中值。 图表的源数据可作为补充数据 7 或 FigShare。

  图4：益生菌干预下，F. prausnitzii ATCC 27768发生SNVs功能注释，并计算dN/dS比值。(a) F. prausnitzii 的 17 个自适应 SNV 的详细信息。(b) 17个独特SNV在F. prausnitzii 基因组中的位置。所有SNV都属于四种类型的突变(A > G、A > C、G > A 和 G > T)。(c) 硝基还原酶家族蛋白和FprA家族a型黄酮类蛋白的晶体结构。红色的是氨基酸基团。(d) 益生菌消耗导致SNV基因的dN/dS比值(当SNV在9种功能蛋白上同时具有非同义和同义时，可以计算SNV的dN/dS比值)。图形的源数据可用作补充数据7或FigShare。

  图5：益生菌干预诱导的肠道常驻 F. prausnitzii SNV 的遗传力。(a) 使用Lp082进行益生菌干预的独立纵向微生物组研究的实验设计(n=6)。(b) 维恩图显示了益生菌 HNU082 在 I 期(益生菌干预后)和 II 期(益生菌干预后 6 个月)诱导F. prausnitzii产生的独特和共享的SNV。(c)维恩图显示了遗传SNV和变化SNV所涉及的独特和共享的蛋白质。(d)barplot表明了完全SNV遗传蛋白的SNV数目。(e)barplot显示了在益生菌干预过程中瞬时发生SNV的20种蛋白产物的SNV数。图形的源数据可用作补充数据7或FigShare。

  图6： 利用1 M NaOH或4 M NH4OH两种不同的碱基进行两次独立的发酵。符号表示(▼)P. copri DSM 18205T生长，代表OD620 nm在NaOH控制的PYG介质中;(●)在NH4OH控制的PYG培养基中，P. copri DSM 18205T生长为OD620 nm;(▼)P. copri DSM 18205T细胞在NaOH控制的PYG培养基上的生长表现为细胞干重;(●)P. copri DSM 18205T在NH4OH控制的PYG培养基中以细胞干重表示;(▼)NaOH控制PYG培养基中的葡萄糖消耗;(●)在NH4OH控制的PYG培养基中葡萄糖消耗。

  图7：P. copri DSM 18205T有机酸生产概况，符号表示(●) P. copri DSM 18205T生长，表示为OD620 nm。黑色柱代表醋酸，浅灰色柱代表甲酸，深灰色柱代表琥珀酸。