益生元包埋益生菌孢子可调节肠道微生物群并抑制结肠癌

  摘要：人类消化道中居住着大量的共生细菌。虽然微生物疗法是治疗结肠癌等疾病的有效策略，但其安全性仍然是最大的挑战。本文中将具有理想生物相容性的食品、药品添加剂的益生元和益生菌结合起来，构建了一种安全的微生物群调节材料。通过化学修饰的益生元魔芋葡甘聚糖包埋商业丁酸梭菌的孢子(spores-dex)。发现spores-dex在口服给药后可以特异性富集在结肠癌病变部位。在病变部位，葡甘聚糖被丁酸梭菌发酵，从而产生抗癌短链脂肪酸(SCFAs)。此外，spores-dex可调节肠道微生物群，增加产生SCFA的细菌(例如Eubacterium和Roseburia)的丰度，并显着增加微生物群的整体丰富度。在皮下和原位肿瘤模型中，载药spores-dex抑制肿瘤生长分别高达89%和65%。重要的是没有发现明显的不利影响。这项工作揭示了使用高度安全的策略来调节肠道微生物群的可能性，并为治疗各种胃肠道疾病提供了一条有希望的途径。

  b) 结肠癌患者肿瘤组织中细菌种类的饼状图。c,d)从结肠癌患者 ( n = 103)获得的肿瘤样本中梭状芽胞杆菌和芽孢杆菌的水平。数据来自NCBI生物项目PRJNA507548。本研究不包括临床样本采集。e)用于测量梭状芽胞杆菌含量的FISH试验在结肠癌患者的肿瘤和癌旁组织中。f) FISH染色组织中荧光阳性细胞数量的定量分析 ( n = 37)。

  首先，通过对数据库中已经公布的结肠癌患者肿瘤组织中的微生物群结构进行分析，发现梭菌目和芽孢杆菌目分布在患者的肿瘤组织中，且这两个科中的大多数细菌可形成抗逆的孢子。荧光定量结果还表明梭菌属在癌和癌旁组织中普遍存在，且癌组织中梭菌属的细菌多于癌旁组织。

  a) 通过密度梯度离心分离孢子。孢子在第二层富集并用孔雀绿染色。b) 营养细胞在结肠癌皮下和原位模型中肿瘤靶向能力。c) 孢子在结肠癌皮下和原位模型中的肿瘤靶向能力。d)分别用孢子和细菌处理的原位和皮下肿瘤的相对荧光强度。e) 用于分析丁酸梭菌含量的血培养法在各种组织中，包括心脏、肺、肝、肾、脾和肿瘤。f-i)丁酸梭菌的营养细胞和孢子对HCl、胆汁酸、溶菌酶和甲硝唑的抗性。将细菌与盐酸和胆汁酸共培养2小时，与甲硝唑和溶菌酶共培养48小时。

  a) 各种聚合物，包括PEI、PEG、PVP-I、PAA、HA和葡聚糖，对丁酸梭菌增殖的影响。b) 通过主客体化学结合益生菌和益生元的示意图。c) spores-dex和细菌-dex的共聚焦激光扫描显微镜图像。d) 经口灌胃后不同时间点消化道的代表性图像。e) 用细菌、孢子和spores-dex处理的小鼠肠道中总荧光强度的定量分析。在经口饲后12小时进行分析。f) spores-dex在原位结肠癌小鼠消化道中的分布。肠上的肿瘤用白色圆圈标记。g)小鼠中的肿瘤组织。孢子-dex用绿色荧光标记。h) 定量分析肿瘤和邻近组织中的spores-dex数量。

  电中性聚乙二醇(PEG)和葡聚糖(Dex)显着促进了丁酸梭菌的生长。考虑到抗PEG抗体在人体内的广泛分布，因此本文通过β-环糊精与葡聚糖(Dex)的主客体相互作用合成特异性位点蛋白质-聚合物共轭物，将益生元葡聚糖包裹在丁酸梭菌孢子外，在肠道的厌氧环境中，葡甘聚糖包埋的孢子(spores-dex)会复苏并分解葡甘聚糖。继而在肿瘤组织中特异性富集，葡聚糖的引入改善了肠黏附，促进了丁酸梭菌的发酵然后产生大量抑癌的短链脂肪酸(SCFA)。

  a) spores-dex在厌氧条件下合成SCFA的体外能力。b) spores-dex抑制CT26细胞生长的能力。c) spores-dex口服法对肝功能、肾功能和血液的影响。d) 皮下或原位CT26肿瘤小鼠的治疗时间表。e) DC@spore、孢子、细菌、DC和PBS对皮下CT26肿瘤小鼠的体内治疗效果。f) DC@spores-dex、孢子、细菌、DC和PBS在携带原位CT26肿瘤的小鼠中的体内治疗效果。g) 治疗第15天小鼠腹部生物发光强度的定量分析。

  体外研究了spores-dex的体外抗癌作用：通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)验证了SCFA的生成。spores-dex和spores都产生了大量的SCFA，尤其是醋酸盐和正丁酸。图4c：口服细菌或孢子-dex后，血液中白细胞、粒细胞、中间细胞和淋巴细胞含量没有显着变化。该结果表明，由益生菌和益生元组成的spores-dex在动物模型中的口服给药是安全的。图4e：DC@spores-dex治疗在12天的治疗中显示出高达89%的肿瘤抑制率。单独的DC或细菌治疗可抑制约15%的肿瘤生长。图4f：结果表明DC@spores-dex可能抑制结肠癌的侵袭。

  a) PBS、细菌、孢子和孢子-dex处理的原位荷瘤小鼠中鉴定出的细菌菌株的维恩图。b) 用PBS、细菌、孢子和spores-dex处理后，原位肿瘤小鼠肠道微生物群落属之间相互作用的圆形图描述。显示了三个生物学重复。c) spores-dex和PBS处理的小鼠之间肠道微生物群的差异。比较了每种细菌的鉴定读数和总测序的 16S rDNA。d) 处理后粪便产生 SCFA 的细菌的变化。e) 不同处理后的粪便SCFA水平。GC-MS 分析用于分析处理第14天的粪便SCFA水平。f) spores-dex调节肠道微生物群和抑制肿瘤生长的可能机制示意图。g) Cape@spores-dex、Cape@spores-dex+抗生素混合物和PBS在携带原位CT26肿瘤的小鼠中的体内治疗效果。

  DC@spores-dex治疗是否可以通过改变肠道微生物群来影响结肠癌：图5a：可能是由于孢子和 spores-dex治疗缓解了微生物群失调。图 5b、c：spores -dex处理后，多个属的丰度显着增加，一些细菌菌株会在肠道中产生短链脂肪酸(SCFA)。图5d：spores-dex 组的高度多样性表明恢复肠道微生物群功能和减缓疾病进展。图5f ：Spores-dex可能通过产生大量SCFA来改变肠道微环境。此外，肠道pH值的降低抑制了其他病原菌的生长，并促进了对酸性环境更具抵抗力的产生SCFA的细菌的增殖。这种级联反应促进了SCFA的产生并最终抑制了肿瘤的生长。

  结论：本文作者构建了一种基于益生元(葡甘聚糖)包裹的益生菌孢子(spores-dex)的治疗系统，用于结肠癌的治疗。作为商业益生菌的丁酸梭菌在肿瘤部位有效富集。且由于益生元易于修饰，化疗药物等可以灵活地装载到该系统中。

  通过口服给药，发现spores-dex在肿瘤组织中富集。通过16s rDNA测序，验证了spores-dex在增加整体丰富度和多样性以及显着增加肠道微生物群丰度方面的能力。同时，产生SCFA的细菌的上调也建立了抑制肿瘤的肠道微环境。在小鼠皮下和原位结肠癌模型中，spores-dex治疗显示出令人满意的肿瘤抑制效果。spores-dex在研究中也没有表现出任何毒性和副作用，因此，spores-dex有望为治疗各种胃肠道疾病提供了一条有希望的途径。

  参考文献：

  Zheng DW, Li RQ, An JX, Xie TQ, Han ZY, Xu R, Fang Y, Zhang XZ. Prebiotics-Encapsulated Probiotic Spores Regulate Gut Microbiota and Suppress Colon Cancer. Adv Mater. 2020 Nov;32(45):e2004529. doi: 10.1002/adma.202004529. Epub 2020 Oct 1. PMID: 33006175.