肠道微生物群是大型微生物群落的储库，在人类健康中发挥着越来越重要的作用。肠道微生物群的紊乱通过病原体直接入侵或代谢介导的干扰引起各种疾病。益生菌补充剂具有抑制病原体定植和发挥有益作用的能力，是积极调节肠道微生物群平衡的有效策略。虽然粪便微生物群移植在预防和治疗方面取得了成功，但其实施在很大程度上受到侵入性手术和不确定成分的限制。

  作为一种非侵入性方法，将益生菌物种口服给肠道微生物群具有明显的意义，可以提供克服这些限制的替代方法。但是环境的复杂性和胃肠道内的持续流动导致口服生物利用度低，肠道定植有限。

  本文用生物膜作为保护涂层封装了益生菌，以调节细菌行为。生物膜不仅起到将菌落附着到表面并防止流动流体移除的粘合剂的作用，而且还通过防止渗透来抵御外部威胁，例如抗生素和宿主免疫系统。生物膜包裹细菌赋予移植的肠道微生物群优越的口服生物利用度和肠道定植。然而，这些尝试只能成功地保护细菌免受环境伤害，能够同时耐受胃肠道应激源和减缓肠道运输的方法对于口服肠道微生物群将非常有用，但仍然极具挑战性。

  生物膜自涂层的设计与表征

  为了证明原理，本文选择了枯草芽孢杆菌(BS)，这是一种有用且重要的肠道益生菌，它与其他有益的胃肠道细菌协同工作，以支持消化、酶产生以及免疫和消化系统健康。在自然界中，为了在不同的极端条件下生存，细菌产生生物膜以对抗物理威胁，例如物理力的位移和环境攻击的移除(图1A)。生物膜不仅起到将菌落附着到表面并防止流动流体移除的粘合剂的作用，而且还通过防止渗透来抵御外部威胁，例如抗生素和宿主免疫系统。生物膜能包裹细菌赋予移植的肠道微生物群优越的口服生物利用度和肠道定植。通过细菌分裂之前用生物膜将细胞包裹，自产生物膜使细菌能够在生长期间被包裹，这可以提供保护和粘液粘附的长期效果(图1B)。 BS 形成了坚固的生物膜，其水负载含量为 93.6 % (wt%)，细菌数量为 8.9 × 10 9 CFU/mL(图 1，C 和 D)。革兰氏染色显示 BS 很好地嵌入生物膜中(图 1E)。透射电子显微镜 (TEM) 图像显示 BCBS 上的整个厚度从纳米到微米不等 (图 1E)。原子力显微镜 (AFM) 图像进一步证实了 BCBS 的固结生物膜，BCBS(全包裹生物膜) 和 FCBS(半包裹生物膜) 相比，细菌边缘不锐利，高度降低(图1G)。

  图1 生物膜自涂层的设计与表征

  生物膜涂层细菌对环境攻击的抵抗力

  口服给药后遇到的第一个挑战是在早期胃肠道中安全地生存低 pH 平衡，这会使益生菌失活 。BCBS 与模拟胃液 (SGF; pH 1.2) 一起孵育以评估生物膜涂层的保护作用。通过在不同时间点的细菌计数确定孵育后的定量存活率(图2A：绿：无膜包裹，蓝：半膜包裹，红：全膜包裹)。胃 pH 值迅速促进细菌细胞壁的通透性，随后通过扩散使细菌失活。生物膜涂层可以有效地保护 BCBS 免受酸性损伤(图2B)。胆汁盐暴露后 BCBS 的存活率始终保持在 28.2% 的高水平(图2C)。TEM观察显示胆汁盐溶解脂质膜，然后破坏细菌。同样，生物膜涂层可以防止胆汁酸的渗透并保持涂层细菌的完整性(图2D)。润湿性通过接触角测角仪测量，正如预期的那样，测试的生物膜表现出130°的接触角，验证了它的高疏水性(图 2E)。

  图2生物膜涂层细菌对环境攻击的抵抗力测试

  小鼠肠道自包被细菌的黏膜粘附

  为了确定生物膜涂层是否可以改善粘膜粘附，在通过管饲法口服施用 1.0 × 10 7 CFUs 的涂层细菌后，在不同时间间隔对粘附在肠粘膜表面的 BCBS 数量进行量化。分别收获小肠(图3A)、大肠(图3B)和盲肠(图3C)。革兰氏染色进一步证明，生物膜的自我包被可以将细菌集中在肠粘膜中(图3D)。 BS 和 FCBS 相比，活力测定和 TEM 图像证实 BCBS 不仅生长更快，而且在肠液中生长过程中产生生物膜(图3E-G)。

  图3小鼠肠道中生物膜包裹细菌

  增强小鼠的口服生物利用度

  为了进一步评估 BCBS 的口服生物利用度。口服管饲 1.0 × 10 7 CFUs 的包被细菌后，在不同时间点分别计算胃(图4A)、小肠(图4B)、大肠(图4C)和盲肠(图4D)中 BCBS 的数量。进一步定量定植在胃肠道中的总 BCBS 以确定口服生物利用度，分别比灌胃 4 小时后的 BS 和 FCBS 高 68 倍和 36 倍(图4E)。苏木精和伊红(H&E)染色显示，给药后第5天与对照组相比，肠组织未出现组织学损伤和形态学差异(图4F)。使用市售的酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒进行细胞因子测定，以测量从施用 BCBS 的小鼠收集的血清中的细胞因子水平。与包括 PBS、BS 和 FCBS 在内的对照组相似，没有感知到炎症反应，这由包括白介素 6 (IL-6)、C 反应蛋白 (CRP) 和肿瘤坏死因子在内的炎症因子水平相当证实–α (TNF-α) (图4G-I)。

  图4 小鼠的口服生物利用度和生物安全性

  增强猪的粘膜粘附和口服生物利用度

  猪可以说是人体器官系统(尤其是胃肠道)最强大的模型之一，它提供了重要的工具和许多转化优势。革兰氏染色显示，大量的 BS 被生物膜包被后附着在肠黏膜上，而未包被和部分包被的细菌的黏膜粘附非常有限(图 5A)。细菌计数进一步体现了显着差异，尤其是十二指肠、空肠、盲肠和直肠(图 5B)。为了研究 BCBS 的存活率，在口服管饲后连续 5 天监测粪便排泄。在给药后第 1 天发现 BCBS 的量高达 2.6 × 10 6 CFUs/g，约为对照组的 60 倍(图 5C)。为了进一步研究 BCBS 在肠道中的保留，在给药后第 2 天对位于肠道各部分的细菌进行计数。与大便内容相一致，十二指肠、空肠、结肠和直肠的BCBS数量显着高于对照组(图 5D)。BCBS 的总定植达到 3.5 × 10 5 CFUs/g，而 BS 和 FCBS 的细菌定植几乎可以忽略不计(图 5E)。

  图5 猪的粘膜粘附和口服生物利用度

  金黄色葡萄球菌肠道定植的治疗

  在确认了涂层细菌的抗性和粘附行为后，我们将注意力转向进一步评估它们是否可以被用作增强的治疗方法。金黄色葡萄球菌是一种广泛存在且危险的人类病原体，可在肠道中定殖并引起多种传染病。与 BS 和 FCBS 相比，BCBS 表现出最高的抑制效力，这可以用模拟肠液 (SIF) 中最快的生长来解释。(图6A)。通过在补充 SIF 的胆汁盐中将金黄色葡萄球菌与 BCBS 共培养，进一步验证了增强的抑制作用，这种情况与体内肠液更相关(图6B)。BCBS在小鼠肠道定植模型中排除金黄色葡萄球菌的潜力(图6C)。用 BCBS 治疗后金黄色葡萄球菌的数量显着下降，在治疗后第 2 天显示出比用 BS 和 FCBS 治疗的小鼠高 10 倍的减少(图6D)。随着时间延长至治疗后 6 天，计数进一步下降至比对照组低 684 倍。通过金黄色葡萄球菌在小肠、盲肠和大肠等肠道中的有限定植进一步证实了增强的抑制作用(图6E-H)。

  金黄色葡萄球菌肠道定植的治疗

  结论：用生物膜进行自我涂层以口服递送肠道微生物群，旨在克服环境攻击和胃肠道中的快速运输时间。在小鼠和猪的体内研究中，自包被的益生菌表现出非凡的胃肠道耐受性和粘膜粘附性，可以显着提高口服生物利用度和肠道定植。自产、包被细菌的特性可以对治疗胃肠道感染产生长期的有益效果。大多数细菌，如益生菌嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，可以在适当的条件下形成生物膜。同时，许多益生菌已被基因编程为自行产生特定的生物膜，这表明生物膜涂层是一种用于口服肠道微生物群的通用策略。凭借在复杂环境中生存和居住的能力，我们预计使用自覆盖生物膜的益生菌来治疗其他疾病，例如呼吸道和生殖道感染。

  参考文献：Wang X, Cao Z, Zhang M, Meng L, Ming Z, Liu J. Bioinspired oral delivery of gut microbiota by self-coating with biofilms. Sci Adv. 2020 Jun 24;6(26):eabb1952. doi: 10.1126/sciadv.abb1952. PMID: 32637620; PMCID: PMC7314526.