空肠弯曲菌通过致死细胞膨胀毒素的作用促进结直肠肿瘤发生

结直肠癌(CRC)在2017 年美国约有135430例新病例和超过50260例相关死亡，是美国最常见和最致命的恶性肿瘤之一。大量证据表明肠道微生物群在CRC发病机制中的重要作用。各种致病菌和肠道病原体与CRC的发展有关，包括拟杆菌属、梭杆菌属、沙门氏菌属、埃希氏菌属和弯曲杆菌属。细菌影响CRC发展的机制包括促进炎症环境、产生影响DNA稳定性的分子和改变增殖反应。微生物来源的毒素可能对致癌作用具有协同作用。

空肠弯曲菌产生一种毒素-细胞致死性膨胀毒素(CDT)，它具有DNA酶活性并导致DNA双链断裂。尽管空肠弯曲菌的感染被证明会促进肠道炎症，但是它对癌症的影响并没有相关研究。

弯曲杆菌在发达国家被认为是地方病，人类感染可导致无症状携带者状态。在CRC患者中观察到梭杆菌属和弯曲杆菌属共存，与正常邻近组织相比，CRC病灶中大肠杆菌和弯曲杆菌属的患病率增加。此外，弯曲杆菌属与IBD的发展有关，IBD是CRC的一个已知危险因素。虽然携带cdt的菌株，例如弯曲杆菌已显示在体外促进 DNA 损伤和基因组不稳定性，但尚未证明CDT在体内的致癌潜力。

人类临床分离株空肠弯曲菌81-176促进小鼠结直肠肿瘤的发生

小鼠在葡聚糖硫酸钠 (DSS) 处理后3周被安乐死，如图所示图1A。结肠镜检查显示在感染空肠杆菌的小鼠的远端结肠中存在大肿瘤(图1B)。在安乐死时，与对照组相比，感染空肠杆菌的小鼠结肠肿瘤数量增加(图1C-E)，两组肿瘤计数显示肿瘤数量显著增加。有趣的是，空肠弯曲菌感染组和对照组小鼠的组织学炎症没有显着差异(图1F)。然而，与对照小鼠相比，在空肠弯曲菌感染小鼠的结肠粘膜中观察到增殖细胞核抗原(PCNA)和核β-连环蛋白的存在增加(图1G))。总之，这些数据表明人类临床分离株空肠弯曲菌81-176促进小鼠结直肠肿瘤的发生。

图1 人类临床分离株空肠弯曲菌81-176 促进小鼠结直肠肿瘤发生和肿瘤生长

CDT亚基CdtB对体外空肠弯曲杆菌诱导的DNA损伤至关重要

为了测试C.jejuni mut cdtB(C.jejuni81-176携带cdtB突变的等位基因)对DNA损伤的影响，从C. jejuni-WT和C. jejuni mut cdtB制备细菌裂解物并将大鼠小肠上皮细胞系IEC-6和人结肠癌细胞系HT-29暴露于这些提取物(5ng/mL)中24小时。与未处理的细胞相比，空肠弯曲杆菌的提取物增加了IEC-6和HT-29细胞中组蛋白H2AX(γH2AX)的磷酸化，这是一种DNA损伤的替代标志物，发现与mut组相比，C. jejuni-WT会导致大量的DNA损伤(图2A-C)。最后，流式细胞术的细胞周期分析表明，虽然C. jejuni-WT促进G2/M细胞周期停滞，但暴露于C. jejuni mut cdtB提取物的细胞未能产生类似的反应(图2D)。此外，我们使用培养的小肠细胞来进一步评估cdtB对肠细胞DNA损伤的影响。与对照相比，将小肠类暴露于空肠弯曲菌裂解物可增强γH2AX，而在暴露于C. jejuni mut cdtB的小肠类中，这种反应减弱(图2E)。这些发现表明cdtB在C. jejuni中起重要作用—体外诱导的DNA损伤和细胞周期停滞。

图2 C. jejuni CdtB 亚基对体外DNA损伤至关重要

C. jejuni诱导的肿瘤发生能力依赖于cdtB

为了评估cdtB在体内空肠弯曲杆菌诱导的肿瘤发生中的作用，我们将GF Apc Min/+小鼠转移到SPF环境中，通过口服管饲法用C. jejuni-WT或C. jejuni mut cdtB (105 cfu )感染它们，并评估肿瘤发展(图3A)。结肠镜检查显示，与C. jejuni-WT相比，感染C. jejuni mut cdtB的小鼠的远端结肠中的肿瘤数量和大小减少(图3B-E)。与这种表型相伴的是，与感染C. jejuni -WT的小鼠相比，感染C. jejuni mut cdtB 的小鼠的结肠黏膜增殖细胞核抗原 (PCNA)和核β-连环蛋白水平降低(图3G)。重要的是，cdtB突变并未损害空肠弯曲菌在体内的结肠炎症、定植和侵袭能力(图 3F,H,I)，表明C. jejuni mut cdtB的致瘤能力降低不是由于细菌定植受损或结肠炎减少所致。总体而言，这些数据表明cdtB对体内空肠弯曲杆菌诱导的肿瘤发生至关重要。

图3 C. jejuni诱导的肿瘤发生能力依赖于cdtB

空肠弯曲菌诱导的肿瘤发生与宿主基因表达和肠道微生物群转录组的改变有关

由于微生物群组成和相关的转录组活动是肠道癌变的重要环境因素，因此评估了空肠弯曲菌及其CDT 毒性对宿主和微生物基因表达的影响。主成分分析(PCA)揭示了C. jejuni-WT的小鼠转录组，而不是C. jejuni mut cdtB-感染小鼠与对照小鼠不同(图 4A、B)。在C. jejuni -WT 和C. jejuni mut cdtB感染的小鼠之间的小鼠转录组中没有观察到显着差异(图4C)。虽然不到1%的 RNA序列归因于微生物基因，但我们注意到，与哺乳动物转录组反应相比，C. jejuni -WT 和C. jejuni mut cdtB 感染小鼠之间的微生物转录组谱显著不同(图 4D–F)，表明微生物群对cdtB 状态的敏感性更高。

图4 产生细胞致死膨胀毒素 (CDT) 的空肠弯曲杆菌影响小鼠和细菌转录组

为了研究空肠弯曲菌和肠道微生物群组成之间的相互作用，我们使用在14天和45天从对照、C. jejuni -WT 和C. jejuni mut cdtB组收集的粪便样本进行了16S rRNA基因测序。缺乏功能性cdtB与早期和晚期感染时间点的微生物群多样性降低有关(图 5A-E)。重要的是，与对照和C. jejuni -WT小鼠相比，C. jejuni mut cdtB的定植通常导致腔室中大量分类群的丢失(图5F,G))。总的来说，C. jejuni感染会改变宿主中的基因表达谱，但在CRC期间对微生物转录组的影响更大。

图5 产生细胞致死膨胀毒素 (CDT)的空肠弯曲菌会改变微生物组成

雷帕霉素减轻空肠弯曲菌促进的小鼠结直肠肿瘤发生和生长

空肠弯曲菌诱导的结肠炎已被证明依赖于 GF Il10 -/-小鼠中 mTOR 信号传导的激活。结肠镜检查显示，与未经雷帕霉素处理的对照小鼠相比，处理组的小鼠中发现的肿瘤不太明显。与对照组相比，雷帕霉素治疗小鼠的结肠肿瘤发生减少(图6B-E)。雷帕霉素不影响结肠炎症的严重程度(图6F),降低了结肠黏膜中PCNA和核β-连环蛋白的水平(图6G)。总的来说，这些发现表明，空肠弯曲菌通过CdtB的作用促进Apc Min/+ /DSS小鼠的肿瘤发生，这是一个受mTOR 信号控制的过程。

图6 雷帕霉素在Apc Min/+ /硫酸葡聚糖钠(DSS)小鼠中减轻空肠弯曲菌促进的结直肠肿瘤发生和生长

结论：C. jejuni产生一种基因毒素，即细胞致死膨胀毒素 (CDT)，它具有DNA损伤潜力，通过cdtB的遗传毒性作用促进结直肠癌。雷帕霉素信号转导哺乳动物靶点的药理学减弱了空肠弯曲菌诱导的致癌作用。肠道微生物群组成和转录组受产生CDT的空肠弯曲杆菌的影响。

参考文献：He Z, Gharaibeh RZ, Newsome RC, Pope JL, Dougherty MW, Tomkovich S, Pons B, Mirey G, Vignard J, Hendrixson DR, Jobin C. Campylobacter jejuni promotes colorectal tumorigenesis through the action of cytolethal distending toxin. Gut. 2019 Feb;68(2):289-300. doi: 10.1136/gutjnl-2018-317200. Epub 2018 Oct 30. PMID: 30377189; PMCID: PMC6352414.