GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数

  前 言

  本标准代替GB 4789.32010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB/T 4789.32-2002《食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测》和 SN/T 0169—2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。

  本标准与 GB4789.3—2010相比,主要变化如下:

  —增加了检验原理;

  —修改了适用范围;

  —修改了典型菌落的形态描述;

  —修改了第二法平板菌落数的选择;

  —修改了第二法证实试验;

  —修改了第二法平板计数的报告。

  食品安全国家标准

食品微生物学检验 大肠菌群计数

  1 范围

  本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。

  本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。

  2 术语和定义

  2.1 大肠菌群 Coliforms

  在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

  2.2 最可能数 Most probable number;MPN

  基于泊松分布的一种间接计数方法。

  3 检验原理

  3.1 MPN法

  MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

  3.2 平板计数法

  大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。

  4 设备和材料

  除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

  4.1 恒温培养箱:36℃±1℃。

  4.2 冰箱:2℃~5℃。

  4.3 恒温水浴箱:46℃±1℃。

  4.4 天平:感量 0.1g。

  4.5 均质器。

  4.6 振荡器。

  4.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL 刻度)、10mL(具 0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头。

  4.8 无菌锥形瓶:容量500mL。

  4.9 无菌培养皿:直径 90mm。

  4.10 pH 计或 pH 比色管或精密pH 试纸。

  4.11 菌落计数器。

  5 培养基和试剂

  5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(laurylsulfatetryptose,LST)肉汤:见 A.1。

  5.2 煌绿乳糖胆盐(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉汤:见 A.2。

  5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar,VRBA):见 A.3。

  5.4 无菌磷酸盐缓冲液:见 A.4。

  5.5 无菌生理盐水:见 A.5。

  5.6 1mol/LNaOH 溶液:见 A.6。

  5.7 1mol/L HCl溶液:见 A.7。

  第一法 大肠菌群 MPN计数法

  6 检验程序

  大肠菌群 MPN 计数的检验程序见图1

  图 1 大肠菌群 MPN计数法检验程序

  7 操作步骤

  7.1 样品的稀释

  7.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。

  7.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。

  7.1.3 样品匀液的pH 应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH 或1mol/L HCl调节。

  7.1.4 用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL 无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。

  7.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。

  7.2 初发酵试验

  每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料 LST肉汤),36 ℃±1℃培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

  7.3 复发酵试验(证实试验)

  用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36 ℃±1 ℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。

  7.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告

  按7.3确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索MPN表(见附录 B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。

  第二法 大肠菌群平板计数法

  8 检验程序

  大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。

  图 2 大肠菌群平板计数法检验程序

  9 操作步骤

  9.1 样品的稀释

  按7.1进行。

  9.2 平板计数

  9.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

  9.2.2 及时将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板,置于36 ℃±1 ℃培养18h~24h。

  9.3 平板菌落数的选择

  选取菌落数在15CFU~150CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大,最低稀释度平板低于15CFU 的记录具体菌落数。

  9.4 证实试验

  从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于 BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。

  9.5 大肠菌群平板计数的报告

  经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数计算。