微生物检验方法验证操作中的关键问题解析

1 定性方法验证中的灵敏度/检出限验证，污染水平要求部分检出？但具体多少算部分？加标部分检出的浓度要求呢？

不仅在GB 4789.45中有要求，ISO16140-2和AOAC通则中也都有部分检出水平的要求，理想情况下部分检出的概率最好是50%，但很难达到，所以对于检出的概率可以放大到25%~75%，部分检出时目标菌的浓度一般是在1CFU以下。

AOAC中提到：食品和饮料部分检出概率浓度一般在0.2-2CFU/样，检测概率1.00水平目标浓度在5CFU/样。环境表面部分检出概率一般10^4-10^6CFU/表面积。

ISO 16140-2中提到的部分检出浓度为0.7CFU。

但这些数据也仅仅只能供我们参考，因为检出水平还受样品基质，菌群类别特性等多方面因素的影响。

2 GB4789.45 对人工污染要求“稀释液添加到样品中，不能影响样品状态”，如何操作？有相关标准可以参考吗？

在我们验证过程中，使用人工污染样的概率是很大的，许多实验室操作人工污染时添加稀释液的比例是比较高的，这对验证结果是有影响的。因为添加菌液过多是会影响到样品本身的特性，例如水分，这样样品在平衡处理过程中就会受到影响。

那么到底多少的比例可以认为是不会影响样品的状态呢？

按照ISO 16140-2中的要求，建议是不超过1%的比例。例如，需要污染的样品质量是25g,我们染菌的菌液量就不能超过0.25mL。很多实验室为了方便都添加1mL，这个量其实就有点高了。对于粉末类样品如果要添加菌粉，添加菌粉的量同样也是按照不超过1%的比例来操作。

3 人工污染样本制备要考虑微生物受损状态下的验证

1.生鲜和冷加工食品接种未处理的微生物；

2.食品一般接种热损伤后微生物（如50℃ ，加热10min）要求获得50%-80%损伤；

3.干燥食品接种冻干培养物。

4 充分验证很重要，大家拿到一份报告怎么看呢？关键看哪些点？

一看包容性和排他性

对于有选择性的项目，如大肠、金葡、沙门等，至少要看有没有做30株目标菌，30株非目标菌。

二看食品样品测试数量（准确度-定量，灵敏度-定性）

如果声称适用于食品大类，至少包括5个食品大类，每个大类6个样品（涵盖3个污染水平），每个样品一般5个重复，算起来150个样品测试，两个方法就是300个测试。

三看相对检出限验证（仅定性）

至少3个污染水平，每个接种20个样品进行测试，总共60个测试。

建议4个污染水平，如：阴性（0CFU/25g）、低浓度（0.1~1 CFU/25g)、中浓度（1~10 CFU/25g）、高浓度（10~100 CFU/25g），以上仅供参考，污染水平也跟食品的限量有关。

5 疑问点：关于定性方法的灵敏度和检出限叫法的解释

灵敏度体现方法对于样品中极低污染水平(部分检出水平)的目标微生物的检出能力，较高污染水平的样品对于定性方法的验证并无太大意义。GB4789.45标准用检出限来表示定性方法的灵敏度。