荧光点亮未来：基于无模板扩增的FEN1活性检测技术及其临床应用潜力

Flap内切酶1（FEN1）是一种结构特异性核酸酶，能够特异性识别并切割分支双链DNA的5'flap结构，在DNA代谢途径（如DNA重组、复制和修复）中发挥关键作用。FEN1的异常调控与多种人类疾病相关，包括自身免疫性疾病、乙型肝炎病毒相关疾病、慢性炎症和癌症。因此，FEN1被视为癌症诊断和治疗的潜在生物标志物，开发一种高灵敏度、简单的FEN1活性检测方法具有重要意义。

近日，北京工商大学食品与健康学院王延波教授团队联合东南大学张春阳教授团队在《Talanta》期刊上发表了一项创新性研究成果，提出了一种基于无模板扩增的“混样即检”法，用于高灵敏度检测人细胞中的Flap内切酶1（FEN1）。这一方法为疾病诊断和药物筛选提供了新的技术平台。

研究结果

长久以来，检测FEN1犹如一场艰难的“战斗”。传统方法，如Western blot analysis和ELISA，操作步骤繁琐，需要昂贵的特异性抗体，灵敏度却差强人意。近年来涌现的基于纳米/微材料的技术，虽然带来了新的希望，但复杂的纳米材料合成、繁琐的洗涤分离步骤以及不尽人意的灵敏度，依旧是横亘在科研人员面前的“大山”。

图 1 基于RNase HII辅助TdT诱导扩增的“混合检测”用于灵敏检测细胞FEN1的原理

此次研究中，科研团队另辟蹊径，创新性地提出了基于无模板扩增的“混合检测”策略，一举攻克了这些难题。如图1，他们设计的哑铃型探针堪称“智慧武器”，3'端的NH₂标记就像为探针穿上了“防护服”，有效抵御非特异性扩增的干扰。当FEN1出现时，它会精准地切割哑铃型探针的5'flap，进而触发一系列精妙的反应，最终产生强烈的荧光信号，让FEN1“无所遁形”。

图 2FEN1检测方法关键反应的实验验证结果展示

图2展示了FEN1催化切割反应及TdT诱导扩增反应的验证结果。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析，可以观察到FEN1能够特异性切割哑铃探针，产生明确的切割产物（图2A）。此外，TdT诱导的延伸反应在合成引物存在时产生了显著的低电泳迁移率产物，证明了TdT介导的延伸反应（图2B）。荧光光谱分析进一步确认了RNase HII辅助TdT诱导扩增反应的特异性，仅在完整反应体系（FEN1+信号探针+TdT）中观察到显著增强的荧光信号（图2C）。因此，该检测方法可以精确检测细胞内FEN1的活性。

图 3 不同浓度FEN1的荧光响应及检测特异性结果图

图3呈现了该方法对FEN1检测的灵敏度和选择性。荧光强度随FEN1浓度增加而显著增强，并在两个浓度范围内（0.05-0.64U/μL和0.00005-0.05U/μL）显示出良好的线性关系，检测限低至5.64×10⁻⁶U/μL（图3A-C）。此外，该方法在多种干扰酶/蛋白（如BSA、λ外切酶、外切酶I等）存在时表现出良好的选择性，FEN1诱导的荧光强度显著高于其他干扰组（图3D）。

此后还通过实验验证了该方法在FEN1抑制剂筛选、动力学分析以及细胞内FEN1活性检测方面的应用和性能。通过ATA作为模型抑制剂，该方法能够高效筛选FEN1抑制剂，并测定了FEN1的动力学参数（最大反应速率Vmax为98.53s⁻¹，米氏常数Km为20.61nM），表明其适用于FEN1的动力学研究。

此外，该方法能够在“混样即检”模式下特异性检测细胞内FEN1活性，A549细胞表现出显著的荧光信号，而热处理的A549细胞无明显信号，且荧光强度在2.5小时内达到稳定，说明该方法可在短时间内完成检测。

在多种细胞系中，肿瘤细胞系（A549、HepG2、MCF-7、HeLa）表现出较高的FEN1活性，而正常细胞系（HL-7702）荧光信号较弱，进一步证明了其在区分肿瘤细胞和正常细胞方面的潜力。此外，荧光强度与细胞数量呈正相关，检测限低至单细胞水平，表明该方法具有高灵敏度和单细胞检测能力。

这一突破性的技术为疾病诊断和药物研发搭建了全新的平台。在疾病诊断方面，有望实现癌症等重大疾病的早期精准筛查；在药物研发领域，能够加速新型FEN1靶向药物的筛选和开发进程。相信在不久的将来，这项技术将从实验室走向临床，为人类健康事业带来更多福祉。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.talanta.2024.126863