单细胞上的“探照灯”：揭秘SECM技术精准捕捉PD-L1表达

免疫疗法作为癌症治疗的新策略，通过激活人体免疫系统来识别和消灭肿瘤细胞。程序性死亡配体1（PD-L1）是一种在多种细胞类型（包括癌细胞）上过表达的跨膜蛋白，它与T细胞上的程序性死亡受体1（PD-1）结合，抑制T细胞功能，使癌细胞逃避免疫监视。因此，PD-L1成为癌症免疫治疗的重要靶点。然而，传统检测PD-L1的方法（如西方印迹、ELISA、流式细胞术和免疫荧光）需要对细胞样本进行大量预处理，如裂解、消化、固定和染色，这些操作不仅破坏了细胞的原始状态，还无法实时监测细胞动态过程。而SECM技术作为一种新兴的分析技术，具有非侵入性、高空间分辨率等优势，可用于单细胞水平的生物成像。

近日，北京工业大学环境科学系的研究团队在《Journal of Electroanalytical Chemistry》上发表了一篇题为“Determination of membrane PD-L1 by SECM technique based on aptamer identification”的研究论文，开发了一种基于扫描电化学显微镜（SECM）技术的膜蛋白PD-L1检测方法，该方法通过核酸适配体（aptamer）特异性识别和酶催化反应，将PD-L1的表达转化为电信号，实现了对单细胞膜蛋白表达的实时、非损伤检测，并为研究污染物对膜蛋白的影响提供了新途径。

研究内容

图 1 SECM检测单细胞膜蛋白表达的示意图

研究团队开发的SECM基方法利用MJ5C这一特异性识别PD-L1的核酸适配体，并将其与碱性磷酸酶（ALP）结合。ALP可催化4-氨基苯基磷酸（PAPP）还原为对氨基苯酚（PAP），PAP在SECM探针尖端的氧化电流响应与细胞表面PD-L1的表达量呈正相关。该方法通过SECM探针扫描细胞表面，检测PAP的氧化信号，从而实现对PD-L1表达的定量分析。

实验中，研究人员使用了HEKA系统的SECM设备，采用直径为10µm的铂盘电极作为工作电极。首先，NCI-H1975细胞和MCF-7细胞分别与200nM生物素化的MJ5C（MJ5C-B）孵育40分钟，随后与6μg⋅ml⁻¹的链霉亲和素-碱性磷酸酶（ALP-S）孵育10分钟，以实现对PD-L1的特异性标记。在SECM测量中，使用Ru(NH3)6Cl3作为指示剂，在-0.35V vs Ag/AgCl的条件下进行接近和定位实验；在含有1mM PAPP的HEPES缓冲液中进行PD-L1测量，探针在0.40V vs Ag/AgCl的电位下捕获PAP的氧化信号，记录的电流响应（ΔI）为峰值电流与背景电流之差。

图 2 荧光成像与SECM检测结果对比

如图2，通过荧光成像确认MJ5C能够特异性识别NCI-H1975细胞膜上的PD-L1，而MCF-7细胞（PD-L1表达量低）则无明显荧光信号。SECM线扫描结果显示，仅当NCI-H1975细胞同时存在ALP-S和MJ5C-B时，才出现特征性的电流-距离曲线，表明ALP成功连接并特异性结合到MJ5C-PD-L1上。

图 3 细胞形貌的SECM表征及针尖-基底距离优化

研究人员通过SECM接近曲线确定细胞高度约为10µm，并优化了探针与基底的距离为15µm（探针与细胞的距离约为5µm），以获得最佳的空间分辨率和电流响应。此外，还优化了MJ5C的浓度（200nM）、孵育时间（40分钟）和ALP-S的浓度（6μg⋅ml⁻¹），以实现对膜PD-L1的最佳检测效果。

图 4 NCI-H1975和MCF-7细胞的SECM成像及PD-L1表达定量分析

通过SECM成像技术，研究人员获得了NCI-H1975细胞和MCF-7细胞的高分辨率图像，用于绘制PD-L1表达水平。结果显示，NCI-H1975细胞周围出现明显的PAP氧化电流（红色区域），表明其PD-L1表达量高；而MCF-7细胞则几乎没有电流增强（蓝色区域），证实其PD-L1表达量低。通过线扫描测量，NCI-H1975细胞的电流响应差值（ΔI）约为0.9pA，而MCF-7细胞的ΔI值接近0pA，表明该SECM方法能够有效区分不同细胞类型的PD-L1表达水平。

图 5 不同处理条件下PD-L1表达变化

研究人员进一步利用该SECM方法研究了白藜芦醇（一种抗癌药物）对PD-L1表达的影响。实验结果表明，低浓度白藜芦醇（0-20µM）可上调PD-L1表达，ΔI值随浓度增加而增大，至20µM时达到最大值（约2.7pA）；而高浓度白藜芦醇（50-100µM）则导致PD-L1表达下调，ΔI值低于未处理细胞的基线水平。此外，还研究了二苯并噻吩（DBT，一种含硫多环芳烃类污染物）对PD-L1表达的影响，发现DBT能诱导PD-L1上调，且呈浓度依赖性，在10µM时ΔI值达到峰值（约2倍增加），随后在更高浓度下下降。同时，细胞活性实验表明，白藜芦醇处理对细胞活性影响较小，而DBT处理则导致细胞活性随浓度增加而降低，这与氧化应激诱导的细胞炎症一致。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jelechem.2025.118999