新型水凝胶检测技术助力蘑菇病原菌快速检测

蘑菇富含蛋白质且热量低，在全球食品市场中占据重要地位，2018 年新鲜蘑菇全球市值超 350 亿美元。但蘑菇适宜的栽培温度（23 - 30°C）也利于真菌病原菌滋生，嗜菌枝顶孢引发的蛛网病是食用菌生产中的重大威胁，感染后会致使蘑菇减产 20 - 30%。传统检测方法，如真菌培养耗时至少 48 - 72 小时，定量实时聚合酶链反应（qPCR）虽常用，但对实验设备、场地和人员要求高，限制了其在大规模生产中的应用。因此，开发快速、准确且可视化的检测方法迫在眉睫。

此次研究的核心技术是将重组酶辅助扩增（RAA）与 CRISPR/Cas12a 系统集成在聚乙二醇（PEG）水凝胶中，构建了名为 RCCH 的检测体系。该体系由双层水凝胶组成，下层水凝胶用于 RAA 反应，扩增目标 DNA；上层水凝胶含有 CRISPR/Cas12a - crRNA 复合物。当目标 DNA 经 RAA 扩增后，与上层的 CRISPR/Cas12a - crRNA 复合物结合，激活 Cas12a 的反式切割活性，切割单链 DNA 报告探针，释放荧光基团，在荧光显微镜下可观察到清晰可数的荧光斑点，实现可视化检测。

研究人员对 RAA 反应条件，包括镁离子浓度、温度和时间，以及 CRISPR/Cas12a 系统的反应条件进行了优化。优化后的 RCCH 检测限低至 1 fg/μL，远低于传统 RAA 检测限（100 fg/μL），且对常见真菌（如绿色木霉、哈茨木霉）和宿主蘑菇（香菇）具有高度选择性，仅嗜菌枝顶孢能引发显著的荧光信号增强。同时，研究还开发了一种超简单的粗提 DNA 方法，使用含 0.75 M NaOH 和 50 mM Tris 的提取缓冲液，1 - 3 分钟即可完成 DNA 提取，高效且节省资源。

图 1：RCCH 检测系统示意图，展示双层水凝胶及各成分反应原理。

图 2：RAA 检测嗜菌枝顶孢的优化条件及检测限分析结果。

图 3：CRISPR/LbaCas12a 检测嗜菌枝顶孢的示意图及条件优化。

图 4：RAA - LbaCas12a 检测嗜菌枝顶孢的检测限和特异性分析。

图 5：嗜菌枝顶孢 DNA 提取缓冲液的优化过程及结果。

图 6：水凝胶可视化检测系统的性能及实际样本检测结果。

与其他类似技术相比，RCCH 优势明显。其检测时间小于 40 分钟，在检测限和检测时间上表现出色。例如，检测番茄早疫病菌的类似技术检测限为 10 - 3 ng/μL，耗时超 2 小时；检测金黄色葡萄球菌的技术虽检测限低至 1.344×10 - 7 ng/μL，但可视化信号不针对目标特异性。而 RCCH 能在 40 分钟内完成检测，检测限达 1 fg/μL，还可对感染的香菇子实体和菌棒等实际样本进行有效检测。

不过，RCCH 目前也存在一些局限，如反应需在小室玻璃片上分两步添加水凝胶，操作较复杂，且依赖加热仪器和荧光显微镜读取结果。后续研究将聚焦于开发集成微流控平台，实现水凝胶一步添加，并探索基于智能手机的荧光检测平台，提升其在野外和资源受限环境下的实用性。

总的来说，RCCH 系统为嗜菌枝顶孢的检测提供了新方案，在作物和植物病害田间检测领域具有广阔的应用前景，有望为蘑菇产业安全生产保驾护航，助力农业可持续发展。

参考文献：Kong F, Peng S, Zhang Y, et al. Spatial double-layer hydrogels enabled visual detection of Cladobotryum mycophilum based on recombinase-aided amplification-CRISPR/Cas12a[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2025: 142304.