新型 CRISPR/Cas12a 检测系统：高效检测耐药微生物中的 BlaOXA-1 基因

抗生素耐药微生物的快速出现对全球公共卫生构成了严重威胁。传统的检测方法，如基于培养的技术，往往速度慢、灵敏度低，难以满足早期诊断的需求。而先进的分子方法，如下一代测序（NGS）和基于 CRISPR 的诊断技术，为快速精准检测耐药基因带来了新的希望。BlaOXA-1 基因编码一种能水解苯唑西林的 β - 内酰胺酶，存在于多种细菌的耐药基因组中，包括肠杆菌科、摩根菌科等多个菌科的微生物。目前检测产 OXA - 1 微生物的方法大多耗时久，还需要专业设备和专业人员操作，难以满足实际需求。

此次研究团队开发的 PCR - 偶联 CRISPR/Cas12a 荧光检测法主要包含两个关键步骤：一是采用常规 PCR 进行预扩增，这一步骤能够将目标基因片段进行扩增，便于后续检测；二是利用 CRISPR/Cas12a 对单链 DNA 荧光报告分子的非特异性水解特性进行核酸检测。预扩增步骤仅需 65 分钟，检测步骤更是缩短至 5 分钟，整个检测过程高效快捷。

图 1：展示不同引导 RNA（crRNA_blaOXA - 1_63 等）检测 BlaOXA - 1 基因时的荧光信号差异，crRNA_blaOXA - 1_63 和 crRNA_blaOXA - 1_221 信号更强。

图 2：呈现不同引导 RNA 检测 BlaOXA - 1 基因的信噪比变化，crRNA_blaOXA - 1_221 早期检测性能更优。

在实验过程中，研究人员精心挑选了针对 BlaOXA - 1 基因的引导 RNA（gRNA），并对多种荧光报告分子和检测缓冲液进行了优化。实验结果令人惊喜，该检测系统展现出超高的灵敏度，每个反应中最低可检测到 1.25 个拷贝的 BlaOXA - 1 基因。不仅在检测 BlaOXA - 1 模型基质时表现出色，在检测临床分离的 BlaOXA - 1 阳性微生物时也成效显著。

图3：展示不同荧光报告分子在不同缓冲液下检测 BlaOXA - 1 基因的信噪比，HOLMES Buffer 1 下 ssDNA - FQ reporter 整体信噪比最高。

此外，研究人员还对该检测系统进行了多方面的优化评估。在荧光报告分子的选择上，TTATT - 5C、8C FQ - reporter 等新型报告分子相较于传统的 ssDNA - FQ 报告分子，在荧光信号强度和信噪比上都有显著提升。在缓冲液方面，改良后的 HOLMES Buffer 1 能显著增强荧光信号，提升检测性能。

图 4：显示不同荧光报告分子检测 BlaOXA - 1 阳性样本的信噪比，ssDNA - FQ reporter 信噪比特性更优。

研究团队使用该优化后的检测系统对 50 份 BlaOXA - 1 阳性临床菌株和 11 份阴性对照样本进行检测，所有报告系统都成功检测出了阳性样本。其中，ssDNA - FQ 和 Stem - loop #10T 报告分子在检测中表现尤为突出，能产生更高的荧光信号和更优的信噪比。

图 5：比较不同荧光报告分子检测 BlaOXA - 1 阳性和阴性样本的正阴性信号比，ssDNA - FQ reporter 和 Stem - loop #10T 判别能力更好。

不过，研究人员也指出，该检测系统仍有提升空间。未来计划用重组酶聚合酶扩增（RPA）或其他等温扩增技术替代 PCR 预扩增步骤，这有望将总分析时间缩短近一半，从 70 分钟降至约 40 分钟，同时减少对专业热循环设备的依赖，使检测更适用于资源有限的环境。此外，开发单管系统将进一步简化操作流程，降低污染风险。

这项研究成果为耐药微生物检测领域带来了新的突破，其开发的检测系统灵敏度高、速度快、操作相对简便，有望成为全球抗微生物耐药性（AMR）监测的有力工具，助力缓解抗生素耐药微生物带来的全球性威胁，为临床诊断和感染控制提供更有效的技术支持。

参考文献：Tyumentseva M, Tyumentsev A, Prelovskaya A, et al. Ultrasensitive CRISPR/Cas12a-Based System for Detection of Bla OXA-1 Gene in Antibiotic-Resistant Microorganisms[J]. Current Issues in Molecular Biology, 2025, 47(4): 238.