全自动高通量 qPCR 系统成功适配胃肠道病毒检测组 可同步检测七种常见肠道病原体

感染性胃肠炎作为全球重大公共卫生问题，每年导致约 20 亿例腹泻病例，其中肠道病毒是急性胃肠炎的主要病因之一。诺如病毒、轮状病毒、腺病毒等不仅是儿童急性胃肠炎的主要病原体，可导致重症患儿住院治疗，还可能在免疫功能低下人群中引发持续性感染、慢性腹泻甚至全身并发症。传统检测方法如抗原检测、显微镜检查和细胞培养等，因耗时长、灵敏度低、无法同时检测多种病原体且特异性不足，难以满足临床快速诊断和疫情防控需求。实时荧光定量 PCR（qPCR）技术虽已成为主流检测手段，但手动操作流程存在污染风险高、通量有限、依赖专业技术人员等缺陷，因此开发全自动高通量的肠道病毒检测方法具有重要临床意义。

本研究针对上述问题，在 Roche cobas 5800/6800/8800 全自动高通量 qPCR 系统上，适配并验证了一种名为 NRA_SAE_UCT 的胃肠道病毒多重 qPCR 检测组，旨在实现对粪便样本中多种常见肠道病毒的快速、精准、高通量检测。该检测组通过两组多重 PCR 反应覆盖七种病原体：诺如病毒 GI 和 GII 基因型、轮状病毒 A 组、腺病毒、札幌病毒、星状病毒和肠道病毒 A-D 组。检测设计中，引物和探针经过多轮优化，例如针对札幌病毒遗传多样性，采用两种不同荧光染料（Atto 425 和 Atto 550）标记的探针，分别覆盖 I、II、V 基因型，确保对不同变异株的包容性；同时通过 2’O - 甲基 RNA 修饰引物 3’端，有效减少引物二聚体形成，提升反应特异性。检测体系整合于 cobas 系统的通用通道（UCT），实现从样本提取、核酸扩增到结果分析的全自动化流程，并通过内置 RNA 全流程控制物监控检测过程的可靠性，避免假阴性结果。

图 1：展示各病毒检测下限（LoD）及 95% 置信区间，通过 2 倍稀释临床样本并结合数字 PCR 定量，验证检测灵敏度。

在分析性能评估中，研究团队采用数字滴度 PCR（ddPCR）对临床样本进行准确定量，以确定检测下限（LoD）和线性范围。结果显示，除诺如病毒 GI（3,180 dcp/ml）、诺如病毒 GII（299 dcp/ml）和轮状病毒（851 dcp/ml）外，其余靶标如腺病毒（54.6 dcp/ml）、札幌病毒（57 dcp/ml）、星状病毒（65.4 dcp/ml）和肠道病毒（29.4 dcp/ml）的 LoD 均低于 100 dcp/ml，显示出较高灵敏度。线性范围测试表明，所有病原体在 5–6 个对数级浓度范围内（如 10¹–10⁶ dcp/ml）均呈现优异线性（r²=0.992–0.998），斜率接近理论值（-3.32），验证了检测体系在宽浓度范围内的可靠定量能力。精密度测试中，批内变异系数（CV）低于 2.95%，日间 CV 低于 3.02%，表明检测结果具有高度重复性和稳定性。包容性和排他性研究进一步验证了检测组的特异性：13 份外部质量评估（EQA）样本均被正确识别，而 26 种常见肠道细菌和 12 种非目标病毒（如 EB 病毒、单纯疱疹病毒）样本均未产生假阳性信号。

图 2：各病1毒线性范围分析，通过系列稀释标准品验证线性拟合度（r²=0.985–0.998）及 PCR 效率。

临床验证阶段，研究团队对 243 份常规检测的粪便样本进行检测，并与商用 CE-IVD 试剂盒（Seegene Allplex GI-Virus Assay 和 TIB molbiol LightMix Kit）进行对比。结果显示，NRA_SAE_UCT 检测组的特异性为 98.2–100.0%，灵敏度为 85.7–100.0%。值得注意的是，腺病毒检测初期出现的特异性差异（90.8%），经第三方试剂验证后发现是由于商用试剂盒仅覆盖 F 种（40/41 型），而本检测组采用泛腺病毒设计，可检测更多血清型，调整后特异性提升至 98.6%。在五个月的常规诊断应用中，该检测组共分析 1,462 份粪便样本，结果显示诺如病毒 GII（7.8% 阳性率）、腺病毒（4.4%）和轮状病毒（1.8%）为最常见病原体，同时检测到 18 例混合感染病例（如轮状病毒与肠道病毒共感染）。尽管 5.1%–6.0% 的样本因含有 PCR 抑制剂初测无效，但通过 1:10 稀释处理后，98.7% 的样本可获得有效结果，表明检测体系对临床复杂样本具有较强适应性。

图 3：常规2诊断应用数据，显示 5 个月内检测 1,462 份样本的阳性率分布、无效样本处理情况及阳性样本 Ct 值特征。

本研究开发的全自动高通量 qPCR 检测组首次实现了七种常见肠道病毒的同步检测，突破了传统单病毒检测的局限性。其核心优势体现在：（1）高效性：单次运行可处理 96–384 份样本，显著提升检测效率，适用于大规模疫情筛查；（2）自动化：全流程无人为干预，减少操作误差的同时降低实验室生物安全风险；（3）临床适用性：对免疫缺陷患者、儿童群体及医院感染控制具有重要价值，可快速提供病原学诊断依据，指导治疗和隔离措施。未来研究可进一步扩展检测范围，整合细菌和寄生虫检测模块，形成全面的胃肠道病原体筛查方案，推动感染性腹泻的精准诊疗和流行病学监测向标准化、智能化方向发展。该研究为全球范围内提升肠道病毒检测能力提供了可靠的技术方案，尤其为资源有限地区的传染病防控提供了高效、可扩展的解决方案。

参考文献：Giersch K, Nörz D, Grunwald M, et al. Adaptation and validation of a gastrointestinal panel to detect diarrheal virus pathogens on a high-throughput qPCR system[J]. Medical Microbiology and Immunology, 2025, 214(1): 1-11.