病毒RNA的快速检测无需预扩增

  摘要：CRISPR/Cas系统被誉为下一代主流分子诊断技术的方向之一。然而，由于CRISPR/Cas的敏感性有限，目前大多数CRISPR/Cas分子诊断仍然依赖于核酸的预扩增，这与商业Taqman-PCR和TwistAmp®Exo试剂盒相比没有显著优势。在此，我们报告了一种aM级敏感级联CRISPR-Dx系统(ASCas)，该系统消除了核酸预扩增，从而避免了气溶胶污染，大大降低了分子诊断的测试环境和人员技能要求。最重要的是，具有高灵敏度和反式裂解效率的Cas13a核酸酶可以在低浓度靶RNA检测下，快速切割杂交级联探针上的RNA气泡，导致级联探针被破坏，释放出大量触发DNA，用于进一步增强Cas12a二级反应的信号。因此，ASCas系统实现了无扩增、超灵敏(1 aM)和超快速(20 min)的RNA检测。此外，ASCas系统用程序化的Cas13a-crRNA设计取代了复杂的引物和探针筛选过程，可以更快速、更直接地构建适合于易突变的SARS-CoV-2病毒的检测系统。

  检测的基本流程如下图所示：ASCas系统的第一阶段信号增强反应是“雪崩”增强的起点，在第一阶段激活的Cas13a会快速切割游离RNA，释放出引发链DNA并迅速参与第二阶段激活Cas12a的切割活性，释放报告基团，获得荧光信号。

  进一步地对该系统进行参数优化如下所示：首先对四种传统的商业CRISPR/ Cas缓冲液(NEB 2.0、NEB 2.1、Tolo Cas12a和Tolo Cas13a)进行了选择，结果显示NEB 2.0缓冲液更适合级联CRISPR/Cas系统;随后测试了ASCas系统在不同温度下的活性，考虑到检测系统的信噪比，最终选择33℃;进一步优化气泡RNA与触发DNA的杂交比例，以保证最佳的信噪比和检测灵敏度;最终确定的级联探针的最佳杂交比为1.5:1;图D的结果表明，增加级联探针的浓度(10 pM-100 nM)有利于提高阳性样品的信号上升率，并且不会对阴性对照产生明显干扰。考虑到成本和ASCas体系中寡核苷酸的总量，最终选择了级联探针的浓度为100 nM;最后，Cas12a-RNP和Cas13a-RNP的浓度会直接影响各阶段信号放大的效率，但过量的crRNA会浪费Cas13a的反式切割活性，导致检测灵敏度降低，因此，Cas12a-RNP的最佳剂量为10 nM;Cas13a-RNP的最佳剂量也是10 nM。

  接下来以SARS-CoV-2核酸标准物为靶标进行ASCas检测;当三种Cas13a-RNP同时加入ASCas系统(各10 nM，共30 nM)时，多重crRNA策略可以显著提高相同浓度的靶核酸检测信号的生长速度，并且体系的特异性良好;对SARS-CoV-2核酸标准品的敏感性试验证实，ASCas系统的检测灵敏度可达1aM;

  为了模拟真实SARS-CoV-2样本的检测性能，作者使用假病毒样本进行实际测试，并将其与金标准RT-PCR的结果进行比较。下图A为伪病毒样本需要额外的核酸提取过程，得到100 μL的SARS-CoV-2核酸样本;在图B、C中，ASCas系统也成功检测到1拷贝/μL的假病毒样品，荧光生长速率与假病毒浓度呈线性关系。验证了ASCas系统能够达到金标准RT-PCR的检测灵敏度。

  总结：

  1、本研究提出了一种高灵敏度级联CRISPRDx系统，可在20 min内检测低至1 aM的SARS-CoV-2核酸标准;

  2、该系统克服了单一CRISPR/Cas系统灵敏度不足的局限性，消除了传统分子诊断方法带来的气溶胶污染的潜在风险;

  3、ASCas系统具有反应条件温和、无扩增子污染风险等优点，可兼容微流控芯片、横向色谱条、电化学检测平台等多种POCT (point -care test)分子诊断传感器。

  参考文献：

  Zhang Y, Chen Y, Zhang Q, et al. An aM-level sensitive cascade CRISPR-Dx system (ASCas) for rapid detection of RNA without pre-amplification[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2023, 230: 115248.