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肝脏里面也有细菌?还能调节免疫?这你信吗?
原创 发布时间:2022-08-17 浏览次数: 2118 来源: 杨娟

核心提示:肠道微生物群形成局部和全身免疫。肝脏与肠道非常相似,密集分布着无数的先天和适应性免疫细胞,这些细胞在生理稳态中至关重要,并通过门静脉循环在宿主和环境之间起到选择性屏障的作用。


——摘要——

  背景: 肠道微生物群形成局部和全身免疫。肝脏与肠道非常相似,密集分布着无数的先天和适应性免疫细胞,这些细胞在生理稳态中至关重要,并通过门静脉循环在宿主和环境之间起到选择性屏障的作用。虽然细菌从其他部位转位到肝脏已被报道,内源性肝微生物组尚未被检查。我们假设肝脏内存在调节肝脏免疫的微生物。

  方法: 无菌采集C57BL/6J小鼠的肝组织和接受肝切除术患者的正常肝旁组织进行16S rRNA测序。实验用由万古霉素、氨苄青霉素、新霉素和甲硝唑组成的口服抗生素治疗小鼠,或单独或联合使用。用肝脏组织免疫组化、流式细胞术和分离的肝脏非实质细胞的单细胞RNA测序来量化和表征对照组和抗生素治疗小鼠的肝脏免疫浸润。

  结论: 在小鼠和人类的肠道中,肝脏中存在着一种活跃的微生物群落。拟杆菌门糖鞘脂NKT轴增强肝脏中的免疫细胞招募和激活。总的来说,我们的数据表明,内源性肝脏微生物群及其代谢产物在调节肝脏免疫和耐受之间的平衡方面至关重要,并可能为肝脏疾病和移植中基于微生物的治疗提供理论基础。

  ——实验设计——


  ——主要结果——

  1. 肝脏里存在微生物

  为了确定肝脏是否有微生物组,作者对正常小鼠肝组织进行了 qPCR。在肝脏中检测到微生物种群,尽管与肠道相比微生物种群数量较低; 肝脏微生物种群数量很容易区分于仅使用试剂的对照组(图A和图S1A,表S1)。16S FISH 和透射电镜显示肝窦腔内存在肝细菌,并被 Kupffer 细胞吞噬(图1B 和图S1B,C)。无菌小鼠没有检测到肝微生物组(图S1B)。同时成功地在需氧和厌氧条件下从无菌获取的肝组织中培养细菌(补充图1D)。为了鉴定肝脏微生物组的特征,我们对6周大的雌性小鼠进行了16S RRNA 测序。肝脏检测到5个不同的门类,其中Bacteroidetes (~50%)、Firmicutes (~25%)、Proteobacteria (~20%)和Verrucomicrobia (~4%)最多(图1C)。值得注意的是,蛋白细菌在肝脏微生物组中所占的比例是肠道的40倍,而Firmicutes在肠道中所占的比例是肠道的2倍。在属水平上,肝脏中Delftia和Coprococcus明显增多,而肠道中包括Lactobacillus,Ruminococcus和Clostridium在内的许多类群更为普遍(图1D,E)。利用线性判别分析效应大小(左撇子)评估支系丰度揭示了整个分类层次中肝脏和肠道之间微生物组成的差异(补充图1 E)。同时,作者成功地在需氧和厌氧条件下从无菌获取的肝组织中培养细菌(补充图1D)。


  图 1.肝脏微生物组与小鼠肠道不同。(A)使用qPCR在6周龄雌性WT小鼠的肠道和肝脏中测量细菌DNA含量。n = 5。**P < 0.01。(B)FISH使用16S探针评估肝内微生物组的存在。显示代表性图像。比例尺:20 μm。(C)根据16S rRNA-Seq确定的相对(Rel.)丰度的平均百分比分配给肠道和肝脏门级的微生物群的分类组成。n = 10。**P < 0.01;P < 0.0001。(D) 显示日志的热图2-转化肝脏和肠道中最具代表性的细菌属的相对丰度。(E)基于16S rRNA-Seq的线性判别分析(LEfSe)在肝脏(蓝条)和肠道(红条)中发现了差异丰富的属。(F) 基于布雷-柯蒂斯相异矩阵的加权 PCoA 图。每个符号代表肝脏(蓝色)或肠道(红色)的样本。聚类由成对的PERMANOVA确定。x 轴和 y 轴表示变异百分比,省略号表示 95% 置信区间。(G)分析6周龄雌性WT小鼠的肝脏和肠道微生物组,以α多样性指标,包括观察到的OTUs,Chao1,ACE,PD以及Shannon和Simpson指数。**P < 0.01;P < 0.0001。(H–J)用FMT治疗无菌小鼠。将供体FMT浆液、受体肝脏和受体肠道中微生物群的分类组成分配到门(H)和属(I)水平,并根据16S rRNA-Seq确定α多样性测量(J)。n = 5。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001;P < 0.0001。

  2. 肝脏微生物群从肠道选择性获得

  首先,作者假设肝脏细菌的来源是肠道微生物群。为了验证这一假设,作者选择口服荧光标记的牙龈卟啉单胞菌,之后检测起在肠道和肝脏中的丰度。假设得到验证,牙龈假单胞菌易位到肝脏,线性回归分析表明,尽管胃和十二指肠中牙龈假单胞菌的丰度在时间上有所下降,但其在肝脏中的丰度仍保持稳定(图F)。

  为了测试肠道微生物是否会具有选择性,作者将来自特定无病原体(SPF)供体小鼠的粪便微生物移植(FMT)给无菌小鼠。在无菌小鼠中,FMT成功地将肝脏与肠道连接起来(图1H,I)。从遗传学的角度来看,FMT 的数据表明肝脏微生物组是由肠道选择性地给予的。

  3. 人类肝脏的微生物组不同于肠道

  在16S rRNA测序数据ß多样性分析中,人类微生物群与肠道分离聚集(图2A)。此外,与我们在小鼠中的发现类似,Bacteroidetes在肝脏中的数量明显多于肠道,而Firmicutes则较少(图2B)。同样,基于OTU、chol、ACE和PD的a-多样性分析显示,与肠道相比,人类肝脏中的微生物丰富度明显较低,基于Shannon和Simpson指数的均匀度也有所下降,这再次与我们在小鼠中的发现相似(图2C)。综上所述,这些数据表明,人类肝脏中存在一种富含Proteobacteria的微生物群,这与肠道不同。


  图 2. 肝脏微生物组与人类肠道不同。(A–C)用16S rRNA-Seq分析来自26名患者的匹配肝脏和粪便标本。显示了基于Bray-Curtis相异性矩阵(A)的加权PCoA图,基于相对丰度平均百分比(B)分配到门级的微生物群的分类组成以及α多样性测量(C)。*P < 0.05;P < 0.0001

  4. 肝脏微生物组因年龄、性别和环境影响而不同

  为了确定肝脏的微生物组随年龄变化,作者对6-48周龄雌性小鼠的肝脏微生物组进行了比较分析。而6周龄小鼠肝脏中最丰富的门类是拟杆菌门和厚壁菌门,随着小鼠年龄的增长,这些门类减少,变形菌门变得最为丰富(图3A)。相比之下,拟杆菌类和厚壁菌类仍然是所有年龄段肠道中最丰富的门类(补充图2A,B)。在属水平,Pseudomonas和Delftia成为优势分类群在老龄小鼠的肝脏中(图3B)。Pcoa 显示了不同发育年龄小鼠肝脏微生物群落的明显聚集性(图3C)。此外,随着动物年龄的增长,肝脏微生物群落的丰富度和均匀度显著下降(图3D)。


  图3. 肝脏微生物组随年龄而变化。(A-D)我们通过16S rRNA-Seq比较分析了6,12,24和48周龄雌性小鼠的肝脏微生物组。根据相对丰度的平均百分比,将肝脏中微生物群的分类组成分配到门(A)和属(B)水平。基于Bray-Curtis相异性矩阵(C)的来自每个队列的加权PCoA图,并显示了与6周(D)相比α多样性测量的变化。n = 5/组。*P <0.05;**P < 0.01;P < 0.001。

  作者接下来通过比较成年(48周大)雌性和雄性小鼠来评估肝脏微生物组的性别差异。成年雌性表现出优势的蛋白细菌,如上所示(图3A) ,最丰富的门在成年雄性是拟杆菌(图4A)。雌、雄肠道微生物丰度均较低,雌性肠道微生物丰度以拟杆菌为主,雄性肠道微生物丰度较高(补图2C、 D)。在整个分类等级中,成年雄性和雌性肝脏微生物组之间存在明显的多重附加差异(图4b)。Pcoa 证实了男性和女性肝脏中存在明显的微生物群落(图4C)。此外,男性肝脏微生物组表现出丰富度和均匀度的增加,这在肠道微生物组中不太明显(补充图2E,F)。由于生物体的环境可以影响其驻留的微生物组,作者比较了在 SPF 和非屏障设施中安置的小鼠的肝脏微生物组。SPF 屏障与无屏障设施的小鼠相比,发现不同的肝微生物群(图4D,E)。各组小鼠的肝脏微生物组也有明显差异,在 SPF 屏障设施中,小鼠的肝脏微生物组丰富度和均匀度增加(补充图2G)。综合这些数据表明,肝脏微生物组是动态的,在健康的宿主中变化很大,这取决于生物体的年龄、性别和暴露环境。


  图4. 肝脏微生物组因性别和环境而异。(A-C)我们通过16S rRNA-Seq比较分析了48周龄雄性和雌性小鼠的肝脏微生物组。根据相对丰度的平均百分比(A),将肝脏中微生物群的分类组成分配到门水平。LEfSe检测到所有分类层次结构中肝脏微生物组基于性别的差异,并在分支图(B)中显示。来自每个基于性别的队列(C)的加权PCoA图。n = 5/组。**P < 0.01;P < 0.001。(D)从杰克逊实验室获得的雌性小鼠队列的肝脏微生物群落的加权PCoA图,并在SPF或非barrier vivaria中饲养3周。n = 5/组。(E)从杰克逊实验室或Taconic Biosciences获得的6周龄雌性小鼠队列的肝脏微生物群落的加权PCoA图。n = 10/组。

  5. 调节肠道微生物群会改变肝脏中的细菌群落

  通过FMT 研究显示,肝脏微生物群是从肠道选择性地聚集起来的,假设消融肠道细菌会重新编程肝脏微生物群落。尽管肠道细菌数量减少了99% 以上(图5A-C) ,但是口服抗生素并没有改变肝脏中的总微生物数量。尽管如此,口服抗生素改变了肝脏微生物组的组成,显著降低了拟杆菌门及其亚类杆菌属、菌门目和 S24-7的相对丰度,而其他类群没有受到影响(图5D,E)。基于在所有抗菌药物治疗组中,肝脏中拟杆菌门菌的患病率显著降低(图5F)。


  图 5. 抗生素给药选择性地调节肝脏微生物组的细菌组成。(A)用qPCR对6周龄的广谱抗生素或载体治疗的雌性小鼠的队列进行肝细菌DNA含量比较分析。n = 5/组。(B)用16S FISH在广谱抗生素(Abx)或载体(Ctl)治疗小鼠肝脏中比较肝内微生物组。显示具有代表性的图像和定量结果。n = 5/组。比例尺:20 μm。(C)通过qPCR对6周龄的广谱抗生素或载体治疗雌性小鼠的队列进行肠道细菌DNA含量比较分析。n = 5/组。**P < 0.01。(D)Cladogram显示用广谱抗生素治疗的小鼠肝脏中整个分类层次结构中微生物丰度的变化。(E)用广谱抗生素或载体处理的小鼠肝脏中分配给门级的微生物群的分类组成由16S rRNA-Seq确定。n = 5/组。P < 0.001。(F)用选择性抗生素或载体处理的小鼠肝脏中分配给门级的微生物群的分类组成,由16S rRNA-Seq确定。n = 5/组。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001;P < 0.0001。(G)基于Bray-Curtis异性基质的肝脏微生物群落加权PCoA图。每个符号代表用广谱或选择性抗生素或载体处理的小鼠肝脏微生物组的样本。聚类由成对的PERMANOVA确定。x 轴和 y 轴表示变异百分比,省略号表示 95% 置信区间。(H)分析广谱或选择性抗生素治疗小鼠的肝微生物组,与载体治疗小鼠相比,进行α多样性措施。n = 5/组。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001;P < 0.0001。

  拟杆菌门中的细菌类群是高糖鞘磷脂的生产者,作者假设在抗生素治疗后,肝脏微生物区系合成的鞘糖脂会减少。因此,通过PICRUSt分析进行的群落系统发育调查预测,在使用广谱或选择性口服抗生素治疗后,肝脏微生物组中糖鞘脂合成减少,而非糖基化鞘脂合成没有减少(图6A-C)。此外,鞘糖脂生物合成基因对肝细菌宏基因组的预测贡献与肝脏中拟杆菌门的患病率高度相关(图6D, E)。其他肝细菌门没有显示这些相关性(图6F, G)。总的来说,这些数据表明,口服抗生素并不能减少肝脏细菌总数,但可以选择性地调节肝脏微生物群的群落组成和糖脂特征。


  图 6.抗生素给药改变肝脏微生物组的糖脂特征。(A和B)PICRUSt分析与用载体治疗的小鼠肝脏微生物组中的鞘糖脂神经节苷脂(神经节)(A)和球茎苷脂(球蛋白)(B)生物合成途径。n = 5/组。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001。(C)PICRUSt分析与用载体治疗的小鼠相比,用广谱或选择性抗生素处理的小鼠肝脏微生物组中的鞘脂生物合成途径。n = 5/组。(D和E)鞘糖脂神经节苷脂(D)和球蛋白苷脂(E)生物合成与用广谱或选择性抗生素或载体治疗的小鼠肝脏微生物组中拟杆菌的丰度之间的相关性。每个彩色符号代表一只由特定方案治疗的鼠标。(F和G)标准化β系数,用于线性回归分析鞘脂神经节苷脂(F)和球蛋白苷脂(G)生物合成之间的相关性以及用广谱或选择性抗生素或载体治疗的小鼠肝脏中特定细菌门的丰度。

  6. 肝脏炎性细胞浸润依赖于微生物组

  为了确定微生物组是否影响肝脏免疫,作者用广谱口服抗生素连续治疗小鼠3周,并定量测定肝脏免疫细胞。抗生素治疗使肝脏中CD45+炎症细胞总数减少了约90%(图7A, B)。无论在饮用水中还是连续灌胃中使用抗生素,都可以观察到肝脏免疫细胞的类似减少(图7C)。因此,虽然无菌小鼠肝脏中CD45+的基线数量减少,但从SPF小鼠到无菌小鼠的FMT却增加了肝脏白细胞数量(图7D),但无菌小鼠用抗生素治疗并没有影响肝脏炎症细胞的体积(图7E)。甲硝唑、万古霉素或新霉素/氨苄青霉素的选择性抗生素治疗均可减少肝脏炎症细胞的数量(图7F)。作者认为,该细菌可能通过影响炎症细胞从骨髓到肝脏的招募和肝内白细胞的增殖来控制肝脏免疫细胞的体积。

  为了验证前一假说,将CD45.2 WT小鼠与CD45.1骨髓细胞嵌合,并在第3周开始给予口服抗生素或载体治疗。作者发现,6周时,抗生素治疗减少了肝脏中的嵌合,但未减少脾脏中的嵌合,这表明肠道微生物消融阻止了肝脏免疫细胞从骨髓中招募(图7G, H)。抗生素治疗后,肝脏中的整体白细胞增殖也减少(补充图6B)。这表明抗生素介导的免疫细胞耗竭反应了其募集减少和增殖受损。


  图7. 肝免疫细胞浸润取决于微生物组。(A)在用广谱抗生素(n = 25)或载体(n = 19)治疗的6周龄雌性小鼠中,通过流式细胞术定量肝白细胞。显示了来自4个实验的组合数据。P < 0.0001。(B)在用广谱抗生素或载体治疗的小鼠中,通过IHC将肝白细胞量化为有核细胞的一部分。基于每只小鼠10个HPF的代表性图像和定量分析。n = 10/组。P < 0.0001。(C)通过流式细胞术在对照小鼠或用添加到饮用水中的广谱抗生素处理或通过口服强饲法施用的小鼠中定量肝白细胞。数据代表了两次实验。n = 5/组。**P < 0.01。(D)用载体或FMT处理的SPF或无菌(GF)小鼠中的肝白细胞通过流式细胞术进行定量。n = 5/组。*P < 0.05。(六)通过流式细胞术对用载体或广谱抗生素治疗的GF小鼠中的肝白细胞进行定量。n = 5/组。(F)通过流式细胞术对广谱或选择性抗生素或载体治疗的小鼠的肝白细胞进行定量。数据代表进行了3次的实验。n = 5/组。*P < 0.05;**P < 0.01。(G和H)从第3周开始用口服抗生素或载体治疗具有嵌合CD45.1骨髓的CD45.2小鼠。在6周时确定肝脏(G)和脾脏(H)中的嵌合。n = 10/组。*P < 0.05。(I)肝免疫细胞数量与用广谱或选择性抗生素或载体治疗的小鼠肝脏中拟杆菌丰度的相关性。每个彩色符号代表一只由特定方案治疗的鼠标。(J)标准化β系数,用于简单线性回归分析肝免疫细胞数量与用广谱或选择性抗生素或载体治疗的小鼠肝脏中选择性门的丰度之间的相关性。(K)标准化β系数,用于多元线性回归分析肝免疫细胞数量与广谱或选择性抗生素或载体治疗小鼠肝脏和肠道中拟杆菌丰度的相关性。(L)六周龄雌性小鼠用广谱抗生素治疗,然后用D重新填充。酸性黄素,P。牙龈,或通过胃强饲法载体。n = 每组10只小鼠。1周后通过流式细胞术对肝白细胞进行定量。*P < 0.05。

  7. 微生物组控制着肝脏的免疫表型

  为了进一步表征抗生素治疗对肝脏免疫的影响,作者对口服抗生素和载体治疗的小鼠进行了CD45+肝脏白细胞的单细胞RNA测序(图8A)。在对照组中,髓系细胞占炎症细胞的5%,而在抗生素治疗的小鼠中,这一比例仅为1%。经抗生素治疗后,肝白细胞总量减少约90%,髓系细胞实际体积减少约50倍。肝NK1.1+淋巴细胞和B细胞的相对丰度也降低(图8A)。先天样淋巴细胞,包括yT细胞、ILC细胞和MAIT细胞的相对频率增加。流式细胞术分析证实了抗生素治疗小鼠骨髓细胞频率的急剧下降,包括F4/80CD11b+、F4/80+CD11b-和F4/80+CD11b+巨噬细胞的减少;和CD11b-CD11c+MHC II树突状细胞(图8B-E)。这些差异性在无菌小鼠中不太明显(补充图S6D)。除了清除这些APC亚群外,口服抗生素治疗还下调了它们的MHC II、CD48、CD80和CD86的表达(图8F-H)。且大多数这些变化在脾apc中不明显(补充图6E-G)。单细胞RNAseq分析证实,在抗生素治疗后,肝脏髓系细胞整体活化减弱,抗原呈递机制表达减少(图8I, J)。此外,抗生素治疗后,肝脏髓系细胞中与免疫反应和细胞代谢相关的多种基因被下调,包括氧化磷酸化、干扰素、趋化因子和iNOS信号转导(补充图6J)。上游调控因子的检测证实抗生素治疗后肝脏髓系细胞炎症信号通路减少(图8K)。


  图 8. 微生物组促进肝髓细胞的扩张和成熟。

  (A)六周龄的雌性小鼠接受广谱抗生素或载体治疗。CD45肝白细胞用FACS纯化并用单细胞RNA-Seq分析。使用t-SNE算法确定蜂窝簇的分布。每个聚类都由不同的颜色标识。每个队列中每个簇中细胞丰度的百分比在饼图中描述。(B–E)通过流式细胞术测定用广谱抗生素或载体治疗的小鼠中CD45肝白细胞中不同APC亚群的频率。数据代表了在5次重复中进行超过4次的实验。**P < 0.01;P < 0.001。(F–H)用广谱抗生素或载体治疗的小鼠中肝APC亚群中活化标志物的表达通过流式细胞术测定,并在蜘蛛图中显示。数据代表了在5次重复中进行超过4次的实验。(I)火山图显示,基于用于A的单细胞RNA-Seq的广谱抗生素治疗小鼠与载体的肝髓细胞簇中的基因表达差异。(J)小提琴图比较A中每个治疗组肝髓细胞簇中选定基因的归一化对数表达。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.0001。(K)A中所示的每个治疗组的肝髓细胞簇中上游调节剂的变化。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001;P < 0.0001。(L和M)用从抗生素或载体处理的供体中收获的OVA脉冲肝巨噬细胞对幼稚小鼠进行两次免疫。在最后一次免疫接种后1周,通过测量OVA-右旋体CTL(L)的频率及其表面表型(M)来确定CD8 T细胞活化。该实验进行了两次。n = 5/组。*P < 0.05;**P < 0.01。(N)从抗生素或载体处理的供体中收获的肝巨噬细胞用α-GalCer脉冲并用于免疫幼稚小鼠。CD1d限制性NKT细胞的频率在第二次免疫后1周通过流式细胞术测定。该实验进行了两次。n = 5/组。*P < 0.05。++++

  8. 微生物组通过驱动NKT细胞中的Ccl5信号来促进肝脏炎症细胞的补充

  为了研究抗生素治疗减少肝脏免疫细胞补充的机制,作者探讨了微生物消融时肝脏趋化因子表达变化的单细胞 RNAseq 数据。Ccl5是基线时几乎所有肝白细胞亚群中表达最高的趋化因子(图9A)。Ccl5在 nk1.1+淋巴细胞中的表达最高,并且在使用抗生素后明显减少(图9A,B)。上游分析证实,抗生素的使用减少了肝 NK细胞通过 CCL5及其受体 CCR1和 CCR5的信号传导(补充图7A)。用抗生素治疗后,非趋化因子细胞因子的表达几乎没有差异(补充图7B)。基于这些数据,我们假设在微生物组完整的动物中 NK1.1+细胞通过 CCL5吸收肝白细胞。与假设一致,Ccl5-/-小鼠的肝内炎症细胞比对照组减少了2倍(图9C)。同样,NK1.1+细胞的消耗足以减少肝脏中的白细胞数量(图9D,E)。


  图 9. 微生物组通过促进NK1.1细胞中的CCL5信号传导来驱动肝白细胞募集。+(A和B)用广谱抗生素或载体治疗小鼠。CD45肝白细胞用FACS纯化并用单细胞RNA-Seq分析,如+图 7A.(A)热图,描述两个治疗组每个簇中不同趋化因子的表达水平。(B)小提琴图,比较两个治疗组每个簇中Ccl5的归一化对数表达。P < 0.0001。(C)将肝白细胞总数与WT中的肝白细胞总数进行比较氯化碳5-/-小 鼠。数据代表进行了3次的实验。n = 5/组。*P < 0.05。(D和E)散装CD45(D)和CD45NK1.1的数量++– (E)在用中和αNK1.1 mAb或同种型对照处理的WT小鼠中比较肝白细胞。n = 5/组。*P < 0.05;**P < 0.01。

  CCL5小鼠的肝脏与 WT 相比含有不同的微生物群落(补充图7C,D)。对肝脏NK1.1+细胞群进行亚群集分析,发现NKT细胞构成了一个实质子集(图10A)。此外,NKT细胞是唯一的 NK1.1 亚群,其 CCL5的表达随着抗生素的使用而减少,但是在肠道 NKT 细胞中没有看到这种减少(图10B,C,补充图7E)。此外,与传统 T 细胞(补充图6L,M)相比,抗生素的使用导致了肝 NKT 细胞的全球转录改变(补充图7F,G)。肝脏 CCL5hI NKT 细胞亚群中IFNY和IL10的表达均高于 CCL5lo NKT (补充图7H)。虽然先天性类淋巴细胞簇中的一些细胞表达了 TRAVL1(小鼠墨迹T细胞中表达的不变 A 链) ,但这些细胞并不表达高水平的CCL5; 此外,NKT细胞簇很容易根据许多效应子 NK 标记识别(补充图7I)。与此一致,CCL5与NK1.1在CDID-PBS-57 tetramer+INKT细胞中共表达(补充图 S7J)。


  图 10. 鞘糖脂抗原诱导NKT细胞的CCL5表达。(A和B)用广谱抗生素或载体治疗小鼠。CD45肝白细胞用FACS纯化并用单细胞RNA-Seq分析,如+图 7A.(A)NK1.1淋巴细胞群被亚聚,如3D t-SNE图所示,并在饼图中量化。(B)小提琴图,比较两个治疗组的每个亚簇中Ccl5的归一化对数表达。P < 0.0001。(C)小鼠用广谱抗生素或载体治疗。分析肝脏NKT细胞的CCL5表达。图中显示了代表性的等值线图和定量分析。数据代表了进行超过4次的实验。n = 5/组。P < 0.0001。(D)假设的示意图,即APC将拟杆菌来源的鞘糖脂呈递给iNKT细胞,其上调CCL5以增强白细胞募集。(E和F)α-GalCer或载体ip给予无菌WT小鼠,并比较分析CCL5 NKT细胞(E)和总CD45肝白细胞群(F)的频率。n = 5/组。*P < 0.05。(G)用α-GalCer或载体体外刺激肝白细胞,用流式细胞术检测NKT细胞进行CCL5表达。数据代表了在5次重复中进行的3次实验。*P < 0.05。(H和I)比较CD45肝白细胞(H)和CCL5(I)的CD3NK1.1细胞表达总数和++++++Cd1d–/–小鼠。数据代表了在5次重复中进行的3次实验。**P < 0.01;P < 0.001。(J)六周龄雌性小鼠用广谱抗生素治疗,然后用D重新填充。酸性黄素,P。牙龈,或通过胃强饲法载体。1周后分析肝脏NKT细胞的CCL5表达。n = 10只小鼠/组。*P < 0.05。

  ——结论与展望——

  1. 小鼠和人的肝内菌群与肠道菌群不同,表现为变形菌门的富集及α-多样性的降低;

  2. 肠道菌群可向肝脏易位,并选择性地在肝脏定殖,从而作为肝内菌群的来源;

  3. 小鼠的肝内菌群受到年龄、性别和环境暴露的影响;

  4. 肝脏免疫依赖于肝内菌群(尤其是拟杆菌门),口服抗生素可减少90%的肝脏免疫细胞,抑制抗原呈递细胞成熟及适应性免疫;

  5. 机制上,拟杆菌门产生的鞘糖脂被呈递给NKT细胞后,可促进CCL5信号,从而驱动肝脏免疫细胞的扩增及活化。
       参考文献:DOI:10.1172/JCI151725

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