克服噬菌体在食品和饲料中应用的障碍

1.噬菌体浓度

噬菌体在食品和饲料中的成功使用取决于克服一系列障碍。使用的噬菌体数量非常重要;一般来说，噬菌体浓度越高，目标细菌的减少就越显著。Bai等人发现，在感染倍数(MOI)为103和104的情况下，噬菌体鸡尾酒显著降低了黄瓜和生菜上的沙门氏菌负荷。MOI为104的鸡尾酒导致更大且更持久的减少。在鸡肉片上使用FDA批准的沙门氏菌裂解噬菌体制剂SalmoFreshTM时，也显示了这一点。SalmoFreshTM在MOI为10²和10³时均显著降低了鸡肉片上初始浓度为3 log CFU/g的沙门氏菌。MOI为10³的SalmoFreshTM显著优于MOI为10²的噬菌体。在其他例子中，使用单一的噬菌体控制生牛肉和熟牛肉上的大肠杆菌，而SalmoFreshTM则降低了熏鲑鱼和酸奶中的志贺氏菌水平。在这两种情况下，减少都取决于浓度，最大减少发生在测试的最高噬菌体滴度时。使用ListexTMP100(一种市面上可用的针对单核细胞增生李斯特氏菌的噬菌体)，在MOI为10²的情况下，金枪鱼中观察到的减少量大于MOI为0.1的情况。当单核细胞增生李斯特氏菌的初始浓度较低且ListexTMP100的浓度较高时，效果最为显著。

然而，噬菌体浓度并不是积极结果的决定性指标。在自然爆发的禽致病性大肠杆菌(APEC)疫情中，低滴度的噬菌体鸡尾酒降低了鸡的死亡率和发病率，但在实验感染的鸡中则没有这种效果。这可能是由于自然爆发的非同步性质。在自然爆发中，所有病例都不会处于其感染周期的同一阶段，而低滴度的噬菌体鸡尾酒可能在早期阶段控制感染并阻断传播。这在实验感染中不会发生，因为所有感染都发生在同一时间。

2.添加高浓度噬菌体的可行性

成功进行噬菌体治疗需要大量噬菌体，这引发了关于是否可行地在食品或饲料中部署足够高滴度的噬菌体的问题。有建议将冷却后的鸡肉胴体上的沙门氏菌作为目标，因为数量通常不会超过3 log CFU/g。用500毫升10⁹PFU/ml的噬菌体制剂接种25克火鸡里脊肉样本，足以在七天内显著减少海德尔堡沙门氏菌的数量，并且代表了一个合理的噬菌体制剂应用体积。在FinalyseTM藏皮洗液的应用研究中，每头牛使用一加仑水中含有3×1010菌体。这不足以减少牛皮和胴体上的大肠杆菌O157:H7污染，但考虑到需要一加仑的量，增加使用的滴度可能很困难且成本高昂。可能使用从噬菌体中分离出来的重组表达的内溶素来代替整个噬菌体以避免这个问题，不过，同样需要调查这种解决方案的经济可行性。转基因生物立法批准和消费者接受度的问题可能会限制内溶素在食品安全中的使用。

3.靶向基质的性质

或动物的性质可能会成为噬菌体成功应用的障碍。这些性质会影响噬菌体的效率。在一项研究中，当使用单一噬菌体减少全脂牛奶、脱脂牛奶、能量饮料、苹果汁和液态鸡蛋中的鼠伤寒沙门氏菌时，噬菌体在液态鸡蛋中的效果最小[19]。在所有食品中，除了液态鸡蛋外，噬菌体的滴度都有所增加，而在液态鸡蛋中噬菌体滴度则有所下降。这可能是因为鸡蛋的高粘性基质限制了噬菌体颗粒的扩散和均匀分布，导致噬菌体活性降低和数量减少。类似地，当研究噬菌体鸡尾酒减少牛奶、卷心菜和鸡胸肉中的肠炎沙门氏菌时，效果最大的是在牛奶中。这再次证明了液体允许噬菌体更大的扩散。使用单一噬菌体时，需要使用感染复数(MOI)为107少液态鸡蛋和果汁中的鼠伤寒沙门氏菌负荷，而需要MOI为105能在熟牛肉和鸡肉中获得类似的减少。SalmonelexTM，一种市售的噬菌体鸡尾酒，能有效减少鸡肉上的沙门氏菌。当SalmonelexTM用自来水稀释时，其效果比用经过过滤、钙、镁和钠含量较低的自来水稀释时更有效。温度也会影响噬菌体的活性。例如，与4°C相比，在12°C下，ListShieldTM(一种针对单核细胞增生李斯特菌的市售噬菌体)的抗菌活性会降低。在奶酪制造过程中使用噬菌体减少金黄色葡萄球菌时，观察到噬菌体滴度随着pH值的降低而降低。在动物应用中，可以在给噬菌体之前或与噬菌体联合给予抗酸药，通过提高肠道内的pH值来改善噬菌体的存活率。

4.噬菌体的应用方法

应用方法也可能是实现积极结果的一个障碍。尽管浸泡和喷洒是噬菌体应用的常见方法，但它们也可能产生负面影响。浸泡和喷洒可能会将噬菌体颗粒释放到环境中，浸泡液可能成为交叉污染的来源，而喷洒设备可能并不总是适用于加工环境。

可以采用不同的方法来适应特定情况或扩大噬菌体的活性条件。微囊化噬菌体在减少番茄上的大肠杆菌方面效果显著，并在五天内维持了这种减少。微囊化降低了噬菌体对紫外线的敏感性，并提高了噬菌体在pH值3-7和极端温度下的存活率。游离噬菌体、含有噬菌体的纸张和微囊化噬菌体都立即减少了苜蓿种子和豆芽上的大肠杆菌。五天后，游离噬菌体和微囊化噬菌体相比未处理的对照组具有显著效果。然而，这也可能是情况依赖的，因为在同一项研究中，游离噬菌体在哈密瓜中减少了3个对数单位的单核细胞增生李斯特菌菌落形成单位(CFU/g)，而微囊化噬菌体在同一时期仅减少了1个对数单位的数量。这可能是由于细菌附着到哈密瓜表面的方式以及噬菌体释放和活性的不同方式所致。应用于鸡饲料的噬菌体鸡尾酒(多种噬菌体的混合物)与通过嗉囊灌食引入的噬菌体一样有效，并且代表了一种更为简便的接种方式。噬菌体还可以以更意想不到的方式应用，例如在双壳贝类的净化过程中，将噬菌体添加到净化池的水中。为了获得与使用噬菌体池时相当的减少量，对照池需要更长的处理时间(表1)。

5.什么时候用噬菌体

预必须在加工的正确阶段进行，以获得积极结果并避免细菌再次引入。例如，喷洒了SalmoFreshTM的黄瓜在切片后并没有显示出对沙氏菌少，而未切片的黄瓜却显示出了显著的减少。据信，通过切割传递的噬菌体数量不足以达到显著减少的效果。一个包含六种噬菌体的鸡尾酒显著减少了马铃薯块茎中由黑腐果胶杆菌腐病症状。然而，单独使用噬菌体在未感染的对照块茎中增加了疾病的严重程度。这可能是由于噬菌体生产中的酶或代谢物的存在。这可能限制噬菌体作为预防性治疗的使用，而不是作为干预手段，因为对未感染块茎的潜在损害可能超过减少未感染块茎症状的好处。关于再感染的问题，猪在污染屠宰场环境中仅待两个小时就可能感染沙门氏菌，因此需要在正确的时间进行治疗以避免这种情况。为了减少鸡肉中的弯曲杆菌，干预应在多个阶段进行，因为弯曲杆菌可能会因多种原因重新进入食物中。

6.噬菌体选择

噬菌体存在一些缺点，但可以通过仔细选择噬菌体来克服这一障碍。噬菌体耐药细菌的出现是一个风险。为了降低耐药性问题，可以使用轮换疗法或噬菌体鸡尾酒代替单一噬菌体。只有当没有风险将处理过的细菌重新引入加工环境并导致耐药性问题时，才应使用噬菌体。噬菌体对其宿主的高度特异性在历史上被视为一个缺点，因为它们可能只能感染有限数量的菌株。

随着认识到其特异性将负面影响限制在周围的细菌群落中，这一观点正在发生变化。例如，可以在牛奶发酵过程中使用噬菌体来减少肠致病性或产志贺毒素的大肠杆菌，而不会损害起始培养物的性能。还可以使用多种噬菌体的鸡尾酒来增加靶向的菌株数量。噬菌体可以携带毒力基因或抗生素耐药基因，但通过使用裂解性而非溶原性噬菌体，可以在很大程度上避免这种情况。还有关于噬菌体的免疫原性和细胞毒性的担忧，以及它们对人类健康的潜在影响。还有关于噬菌体的免疫原性和可能由目标细菌裂解引起的细胞毒性的担忧。已经发现噬菌体在大鼠和小鼠中不会引起不良反应，这表明它们对人类使用是安全的。在切达干酪制造中使用的针对金黄色葡萄球菌的噬菌体并没有增加肠毒素的产生。人类经常遇到噬菌体，因为它们在人类肠道、皮肤、动物、污水处理系统以及食物发酵分解过程中等地方自然存在。

【结论】：

噬菌体作为来自天然来源的添加剂，在控制细菌病原体方面显示出希望，这可能比传统添加剂更容易被消费者接受，同时也为日益增长的对抗抗生素耐药性的斗争提供了帮助。噬菌体可能只能减少食品中的细菌数量，而不能完全消除它们，但这并不是一个严重的问题。

在应用噬菌体及其用途时，必须小心谨慎，以确保在噬菌体成为广泛使用和接受的食品加工助剂之前，它们能达到有利的结果。在设计使用噬菌体进行去污或细菌控制的工艺时，必须克服的障碍包括噬菌体浓度、添加高浓度噬菌体的可行性、待处理食品或动物的特性、噬菌体的应用方式、应用时间以及所使用的噬菌体种类。