K5特异性噬菌体和解聚酶对肺炎克雷伯菌的治疗效果

摘要：肺炎克雷伯菌因其严重的抗生素耐药性，已成为感染人类和动物的最难治疗的革兰氏阴性病原体之一。噬菌体和由它们衍生的蛋白质产品作为抗生素的潜在替代品正受到越来越多的关注。本研究分离了一株噬菌体P1011，鉴定并表达K5特异性荚膜多糖降解解聚酶dep1011。通过使用牛的菌株B16（能够支持噬菌体增殖）和人类菌株KP181（不能支持噬菌体扩增）和人类菌株KP181建立小鼠感染模型，探索了噬菌体和dep1011治疗对K5肺炎克雷伯菌的安全性和有效性。结果表明，P1011和dep1011可能作为控制肺炎克雷伯菌K5感染的潜在抗菌剂，且解聚酶的抗菌效果明显优于噬菌体。

一、噬菌体的表征

以菌株B16作为宿主时，分离得到的噬菌体P1011可以形成被晕圈包围的小而圆的斑块。随着时间的推移，晕圈逐渐膨大，显示P1011可能编码解聚酶。以KP181为宿主菌株时，虽然双层平板法未形成斑块，但点样试验显示有一个浑浊的圆圈。透射电镜显示，P1011具有等距多面体头部(65±0.5 nm)和长长的尾巴(168±0.5 nm)。

根据一步生长曲线，P1011的潜伏期为6 min，爆发量为41 pfu/cell；最佳MOI=0.1。超过一半的P1011在pH 3~9下存活，在酸性条件下的活力大于在碱性条件下的活力。超过90%的噬菌体颗粒在4、25和37 °C下保持活性，随着温度的升高，P1011的存活率迅速降低，几乎没有噬菌体在60 °C下存活。

二、噬菌体基因组分析

P1011基因组由49,460 bp组成，GC含量为50.41%。在基因组中未检测到溶原性、抗生素耐药性、毒力因子相关或tRNA相关基因。BLASTn结果显示，P1011与克雷伯菌噬菌体vB_KpnS-VAC112和vB_KpnS-VAC111具有高度同源性，覆盖率为88%，核苷酸相似性为94.33%。系统发育树揭示了其与Webervirus属内噬菌体的密切关系，P1011应该是Caudoviricetes，Drexlerviridae，Webervirus中的一个新物种。共预测了79个CDS，包括内溶素、holin和双尾纤维蛋白。其中CDS34的氨基酸序列与克雷伯菌噬菌体K5-4的K5解聚酶覆盖率为78%，序列同一性为34.06%；与克雷伯菌噬菌体K5-2的K5解聚酶具有71%的覆盖率和34.94%的序列同一性。

三、解聚酶的表达和活性

本实验成功诱导并纯化了名为dep1011的重组解聚酶，dep1011的预测分子量为92 kDa。点样法表明，50 ng的dep1011可以在所有K5菌株上形成裂解斑，包括那些不能被P1011裂解的菌株。加入dep1011后，两种细菌菌株B16和KP181的沉淀物都表现出比PBS更大的压实性。

四、噬菌体和解聚酶的评估

实验分为9组，第1组，阳性对照(感染菌株B16后2 h注射200 μL PBS缓冲液)；第2组，噬菌体处理(感染B16菌株的小鼠，在感染后2 h注射噬菌体)；第3组，解聚酶处理(感染B16菌株小鼠后2 h注射解聚酶)；第4组，阳性对照(感染菌株KP181的小鼠，在感染后2 h注射200 μL PBS缓冲液)；第5组，噬菌体处理(感染菌株KP181小鼠，感染后2 h注射噬菌体)；第6组，解聚酶处理(感染菌株KP181小鼠，感染后2 h注射解聚酶)；第7组，注射噬菌体；第8组注射解聚合酶。第9组注射200 μL PBS作为对照。将菌株B16以^{1×108 CFU}的剂量注射到小鼠体内，体积为200 μL；将菌株KP181以^{4×107 CFU}的剂量注射到小鼠体内，体积为200 μL。噬菌体治疗组每只小鼠腹腔注射剂量为^{1×109 PFU}的噬菌体（200 μL），解聚酶治疗组每只小鼠腹腔注射解聚合酶50 μg。

结果表明，感染菌株B16的小鼠在没有治疗干预的情况均在48 h内死亡。噬菌体治疗组中60%的小鼠存活，解聚酶治疗组中的所有小鼠都存活。此外，用任一药物治疗的小鼠的血液、肺和肝脏中的细菌计数明显低于对照组。感染菌株KP181的小鼠在24 h内在没有治疗干预的情况下和使用噬菌体治疗的小鼠全部死亡，解聚酶治疗组中的所有小鼠都存活了下来。

综上所述，P1011和dep1011作为传统抗生素的替代疗法都显示出巨大的潜力，且与P1011相比，dep1011显示出更好的疗效，表明其更适合医疗应用。本研究结果为噬菌体及其相关酶作为对抗细菌的新工具提供了令人信服的证据。

参考文献：https://doi.org/10.1186/s13567-024-01311-z