噬菌体基因组工程用于噬菌体治疗以对抗细菌的抗药性

噬菌体是特异性感染细菌宿主的病毒，通过裂解或溶原性，或两者兼而有之，被发现是地球上最普遍的微生物，具有单链DNA（ssDNA）或双链DNA（dsDNA）或RNA基因组。在发现强效抗生素后，尽管对噬菌体的研究尚未完全中止，但噬菌体疗法仍滞后。与抗生素不同，噬菌体具有以下优点：（1）开发成本低;（2）对微生物群落无害; （3）无副作用; （4）宿主特异性高; （5）可持续性; （6）适用于核酸操作。然而，在抗生素的黄金时代，耐药性的出现并不具有挑战，人们进行了大量科学研究来克服这种耐药性。尽管随着抗生素在包括医疗保健、兽医、农业和工业在内的许多领域被广泛用作治疗和预防药物，但抗生素耐药细菌的迅速出现现在正成为最具挑战性的问题。

抗生素选择性地干扰细菌细胞的各种功能，包括细胞壁合成、DNA复制和转录、叶酸代谢或蛋白质生物合成。靶向细胞壁的抗生素中最重要的成员是β-内酰胺类抗生素和万古霉素。抗生素包括利福平、氯霉素、大环内酯类、克林霉素、四环素和氨基糖苷类等，属于细菌细胞细菌蛋白质生物合成的抑制剂——在较小程度上靶向细菌 RNA-聚合酶或在很大程度上靶向细菌-核糖体。喹诺酮类药物，尤其是氟喹诺酮类药物（FQ），能够通过抑制DNA旋转酶（拓扑异构酶II）的作用来拮抗细菌DNA复制，因此它们属于细菌DNA复制的抑制剂，而磺胺类药物和甲氧苄啶是叶酸代谢的抑制剂，能够抑制叶酸代谢中截然不同的步骤。抗生素对致病细菌细胞的作用机制图示如下：

图1 抗生素靶向中枢教条的作用机制和致病细菌细胞的代谢

细菌如何对抗生素产生耐药性的图表如图 2 所示。当且仅当细菌宿主可以耐受的这种药物的最佳水平最终不会抑制它们的生长时，细菌才能够对药物产生耐药性。微生物种类，尤其是革兰氏阴性菌，具有固有的对万古霉素产生耐药性的能力。然而，获得性耐药性和选择或自发突变被微生物物种用来产生能够对特定抗生素产生耐药性的微生物菌株，据报道，这些抗生素对所讨论的微生物物种对此类抗生素有反应。

图2 细菌细胞向抗生素耐药性的演变

虽然同源重组 （HR） 传统上是一种自然发生的基因重组类型，但通过这种重组，核苷酸序列在共享相似或相同序列的分子之间交换，重组是一种基因工程介导的重组方法，旨在提高 HR 的发生率。具有双亲噬菌体和单个噬菌体的HR概念（图3）如下图所示：

图3 基于人力资源的噬菌体工程的概念。A = 具有双亲噬菌体的 HR;B=单个噬菌体的HR;白色噬菌体=野生型噬菌体;灰色噬菌体=野生型噬菌体;灰色和白色的噬菌体=重组噬菌体，白色和红色的噬菌体=重组噬菌体

CRISPR/Cas9、ZFN 和 TALEN 通过刺激靶基因组位点的 DSB 来促进基因组编辑。在被刚才提到的靶向核酸酶切割后，靶位点通常会经历两种主要的DNA损伤修复途径之一：容易出错的NHEJ（非同源末端连接）或高保真HDR（同源定向修复）途径，这两种途径都可用于在体内或体外实现所需的编辑结果。基于CRISPR/Cas9的噬菌体工程的概念（图4）如下：

图4 基于 CRISPR/Cas9 的噬菌体工程概念。白噬菌体=野生型噬菌体;灰色噬菌体=突变噬菌体

噬菌体重启需要从噬菌体基因组中获取活化的病毒粒子。这种方法涉及在体内或体外组装具有所需突变的噬菌体基因组，然后通过电穿孔将其转化为细菌宿主细胞。通过噬菌体基因组DNA组装重启噬菌体的概念（图5）如下所示：

图5 通过噬菌体基因组 DNA 组装重启噬菌体的概念。白噬菌体=野生型噬菌体;灰色噬菌体=野生型噬菌体;灰色和白色的噬菌体=重组噬菌体

总而言之，噬菌体基因组工程，尤其是CRISPR / Cas9似乎是更新的分子生物学技术的主题，旨在克服噬菌体的狭窄宿主范围和通过单噬细胞疗法产生的耐药突变体的快速出现。同样，它是开发噬菌体混合物或多噬菌体的最强大和最合适的分子生物学工具，这些噬菌体混合物或多噬菌体已被证明可以有效对抗耐多药细菌。单剂量的基于噬菌体的酶或蛋白质似乎比几剂抗生素更有效，尽管噬菌体或多噬细胞疗法的混合物被证明不仅比基于噬菌体的酶或蛋白质单一疗法更有效，而且还被证明可以使致病菌对噬菌体产生耐药性视而不见。用于噬菌体治疗的酶益生菌或从裂解噬菌体中提取的蛋白质可以作为2050年前消除贫困的潜在资源，不仅可以挽救1000多万人死于抗微生物药物耐药性，而且可以在2030年之前保护≥2400万人摆脱极端贫困。因此，利用基于噬菌体的蛋白质/酶疗法和基于CRISPR / Cas9的噬菌体基因组工程进行噬菌体治疗，这些噬菌体治疗在2050年之前将大大降低细菌抗微生物药物耐药性造成的全球死亡率。

参考文献：Usman, S.S., Uba, A.I. & Christina, E. Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics. Mol Biol Rep 50, 7055–7067 (2023). https://doi.org/10.1007/s11033-023-08557-4