NC 2024.3 ｜ 噬菌体治疗会激发的宿主抗病毒反应吗？问问感染沙门氏菌的鸡

中文题目：在噬菌体治疗过程中，噬菌体的DNA在鸡模型中诱导了一种被中断的免疫反应

期刊及年份：Nature Communications，2024年3月

https://doi.org/10.1038/s41467-024-46555-7

通讯作者： Alicja Węgrzyn（阿丽莎·维格津），波兰格但斯克大学教授，主要研究方向是噬菌体治疗以及免疫反应机制以及噬菌体与宿主免疫系统之间的相互作用。

摘要：抗生素耐药性危机的解决方法之一是利用噬菌体来对抗细菌感染，即所谓的噬菌体疗法。这种治疗方式普遍认为对人类和动物是安全的，因为理论上噬菌体只感染原核细胞。尽管如此，最近的研究表明，噬菌体可能被真核细胞识别，从而引发特定的细胞反应。在这里，我们展示了感染了沙门氏菌并接受了噬菌体混合物治疗的鸡，其体内的噬菌体最初被动物细胞作为病毒识别。然而，cGAS-STING通路（先天抗病毒反应的两条主要途径之一）在IRF3转录因子磷酸化阶段被阻断。这种阻断是由于RNA聚合酶III无法识别噬菌体DNA并产生双链RNA（dsRNA）分子，而这些分子是激活对IRF3磷酸化至关重要的大型蛋白复合体所必需的，这揭示了抗病毒反应受损的机制。  

背景介绍

噬菌体疗法，或称噬菌体治疗，是一种利用噬菌体治疗细菌感染的方法。这些噬菌体是严格寄生于细菌细胞内的病毒，它们在细菌细胞内繁殖。它被认为是治疗由致病细菌引起的人类和动物疾病的潜在疗法。特别是在抗生素危机时代，由于许多甚至全部现有抗生素都对其无效的细菌株的出现，噬菌体疗法尤其值得考虑。然而，尽管对噬菌体疗法进行了多年的研究，这种方法仍然主要处于实验室研究、实验性治疗或临床试验的早期阶段。在医学和兽医学中，尤其是在大规模使用时，关于其疗效和安全性的争议仍然存在。

尽管噬菌体只能感染原核细胞，因此被认为对人类和动物是完全安全的，但近期研究结果显示，这些病毒可以被真核细胞（包括人类和动物的细胞）识别，并诱导特定的反应。甚至有人提出噬菌体可能成为人类的病原体，因为它们能够改变肠道微生物组、调节免疫反应以及与真核细胞相互作用。也有证据表明，噬菌体对人类或动物宿主并非中性。实际上，这些病毒是人类肠道微生物群的重要组成部分，在人体病毒组中占据主导地位，被称为“噬菌体组”。相反，如果考虑噬菌体疗法，为了确保一定的疗效，需要使用大量的噬菌体（至少10^9个病毒粒子或更多），因为已经明确证明（虽然是偶然和错误的，但提供了明确的证据），低剂量的噬菌体，如10^2个病毒粒子，在临床试验中是完全无效的。因此，尽管免疫系统对噬菌体“熟悉”，但它会对突然引入人体或动物体内的大量这些病毒做出反应。由于噬菌体的多样性极大，包括它们遗传物质的各种类型（双链DNA、单链DNA、单链RNA或双链RNA），人类和动物的细胞可能对不同的噬菌体产生不同的反应。例如，带有RNA基因组的噬菌体可能被TLR3受体识别，而那些带有双链DNA基因组的噬菌体可能通过TLR9受体被探测到。在这两种情况下，都会产生干扰素分子，然而，这一过程中涉及的分子信号和特定途径的细节仍然在很大程度上是未知的。  

本研究的目的是鉴定噬菌体DNA识别的分子机制以及真核宿主的反应。作为模型，我们采用了感染沙门氏菌的鸡的实验性噬菌体疗法。我们之前的研究表明，这种治疗在根除致病菌方面是有效的。对鸡肠道微生物组的分析表明，用噬菌体混合物治疗只引起了微生物组成暂时性的变化，这些变化在几周内就正常化了，以乳酸菌科和肠杆菌科的优势为主。这与用抗生素（恩诺沙星或粘菌素）处理的鸟类相反，后者的微生物组直到实验结束都发生了显著变化。然而，我们也证明了，口服给予的噬菌体可以在鸡的各种器官中找到，包括肠道、肝脏、脾脏、肌肉、心脏、肾脏和大脑。这引发了关于噬菌体疗法安全性的问题。有趣的是，后续研究表明，在给鸡使用浓缩的噬菌体混合物（两种噬菌体各10^9个菌斑形成单位（PFU）的剂量）后，鸡的免疫稳态并未受到干扰，这表现在细胞因子失衡的缺乏、关键免疫细胞亚群比例的不变，以及应激轴超活性的缺失（这些特征在同样的实验中被检测为抗生素治疗的不良反应）。实际上，在经噬菌体治疗的鸡中观察到了抗炎细胞因子（IL10和IL4）水平的增加。这引发了关于分子过程的问题，这些过程允许噬菌体被人类或动物细胞识别为病毒，但同时也导致抗炎（而非促炎）反应。因此，本研究的目标是鉴定经口服给予的噬菌体在鸡血液中存在所诱导的抗炎效应信号的分子途径。  

便于更好地理解全文，提前把全文总结和作者提出的通路模型放在此处。

全文总结

本研究首次展示了携带双链DNA基因组并通过口服高剂量（10^9个病毒粒子）给动物的噬菌体能够诱导cGAS-STING途径，然而，这一途径在最后一个阶段，即IRF3因子的磷酸化过程中被阻断。这种阻断机制基于RNA聚合酶III无法识别噬菌体DNA（可能是由于缺乏特定的启动子和/或特定的富含AT的序列，与真核病毒或细菌染色体的DNA形成对比；后者足够大，可能偶然包含类似于RNA聚合酶III特异性启动子的序列，并含有富含AT的区域）以及由此导致的dsRNA的缺失，而dsRNA在正常情况下是刺激IRF3磷酸化所必需的。然而，TLR9依赖途径在噬菌体DNA存在时被完全激活，导致IRF7和NF-κB转录因子的激活，以及随后的IFNβ和抗炎细胞因子的产生。这提供了动物对噬菌体免疫反应的分子机制原理，特别是在检测噬菌体双链DNA和随后的信号传导途径方面。所提出的模型以图解形式展示（见图8）。  

 

图8：动物免疫系统识别噬菌体DNA的模型。我们认为噬菌体DNA会被动物免疫系统的两个系统识别，分别是cGAS-STING系统和TLR9/MyD88系统。TLR9/MyD88系统工作得很高效，能够激活IRF7和NF-κB这两个转录因子，然后产生INFβ这种物质。但是，依赖于cGAS-STING的路径在IRF-3磷酸化这一步被阻断了。这种阻断是因为TBK1和IKKε（它们需要和TANK、TBKBP1、NAP1一起工作）没有被激活，导致IRF3磷酸化过程没有被刺激。这种刺激不足是因为RLRs-MAVS的激活没有响应，这又是因为没有RNA聚合酶III催化噬菌体DNA转录产生dsRNA，原因是噬菌体基因组里缺少特定的富含A-T序列和/或类似真核生物的启动子。这个图是用BioRender.com这个网站制作的（发布许可编号为BQ26HQ0INZ）。

主要结果

在噬菌体治疗期间，鸡血液中的噬菌体DNA至少存在5周，导致IFNβ水平升高

在本研究中使用的实验系统中，将100只鸡分成四组，分别接受以下处理：（1）0.89% 氯化钠（阴性对照）（2）噬菌体混合物（由两种具有双链DNA基因组的噬菌体组成，能够感染沙门氏菌血清型Typhimurium，即vB_SenM-2和vB_Sen-TO17，每只动物给药剂量为10^9 PFU）（3）沙门氏菌血清型Typhimurium（每只动物给药剂量为10^6 个菌落形成单位CFU），（4）沙门氏菌血清型Typhimurium和噬菌体混合物（上述剂量）。沙门氏菌在实验的第一天口服给药，而噬菌体混合物则从第二天开始，连续两周每天口服给药（见图1a）。在实验后的第6天、第20天、第28天和第34天，每组分别牺牲5只鸡，并采集血液样本。

为什么采集血液的时间是第6天、第20天、第28天和第34天这样的天数？

小编认为可能主要为了对早期和晚期反应进行比较：第6天是较早的时间点，用于捕捉初始免疫反应和噬菌体DNA的快速影响。随后的时间点则有助于观察长期效果和任何可能的免疫记忆或适应性变化。

如有不同理解，欢迎留言指正。

在这项研究中，通过PCR检测了血样中噬菌体DNA的存在（PCR分析的检测限分别为vB_SenM-2和vB_Sen-TO17噬菌体DNA的100fg和10fg，相当于vB_SenM-2和vB_Sen-TO17基因组DNA的6.19×10^2和2.08×10^2分子；补充图S1）。有趣的是，在所有给予噬菌体的组中，整个实验期间都能在样本中检测到鸡尾酒中给予的两种噬菌体的遗传物质（图1b，c）。在研究对感染的反应产生的主要因素时，我们检测了干扰素α和β（IFNα和IFNβ）以及TNFα的水平（值得注意的是，以前已经证明，与单独使用噬菌体混合物或同时使用沙门氏菌和噬菌体混合物处理的鸡相比，感染沙门氏菌的鸡的IFNγ水平显著增加）。与仅用0.89%氯化钠处理的对照组鸡相比，感染沙门氏菌的鸟类的IFNα和TNFα水平显著升高，但在用噬菌体混合物处理的组中则没有升高。实际上，与沙门氏菌处理组相比，细菌和噬菌体的治疗降低了IFNα和TNFα的水平，但没有将这些因素的丰度标准化到对照组的水平（图1d，f）。相反，在所有测试时间点，仅用噬菌体处理的鸡的血样中IFNβ水平也增加了（图1e）。因此，这些结果表明，血细胞通过产生IFNβ来响应高剂量噬菌体的治疗。

 

图1：实验程序的方案以及实验过程中IFN和TNF因子水平和噬菌体DNA水平。实验（a）涉及100只小鸡，分为四组（每组n=25）。第3组和第4组在第0天口服感染了S. enterica血清型Typhimurium菌株13（在此时（所有组）采集的样本仅用于质量控制）剂量为10^6 CFU/ml，而第1组和第2组未感染，但口服接受了1 ml 0.89% NaCl。然后，从第1天开始，第1组和第3组每天接受1 ml 0.89% NaCl治疗，持续2周，而第2组和第4组在同一时期接受了1 ml噬菌体混合物（噬菌体vB_SenM-2和vB_Sen-TO17的混合物，每种的滴度为10^9 PFU/ml）治疗。在第6天、第20天、第28天和第34天采集血液样本进行分析。通过PCR检测噬菌体vB_SenM-2（b）和vB_Sen-TO17（c）的DNA，使用针对噬菌体基因组选定序列的特异性引物（显示代表性的电泳图，其中M泳道包含分子重量标记（左侧显示DNA大小），C+和C−泳道分别表示有和没有纯化噬菌体DNA的对照，每个反应重复5次，结果相同）。血液样本还经过处理以释放蛋白质，并用ELISA测量选定多肽的水平。在所有样本中测定了IFNα（d）、IFNβ（e）和TNFα（f）的丰度。在（d-f）中呈现的结果对应于用NaCl（白色柱状图，圆圈代表个体结果）、噬菌体（蓝色柱状图，正方形）、细菌（红色柱状图，三角形）和细菌及噬菌体（绿色柱状图，倒三角形）处理的小鸡（每种子组n=5）的样本，并且是平均值，误差条代表标准差。对于统计分析，使用Kolmogorov–Smirnov检验检查变量分布的正态性，使用Levene检验检查方差的同质性。一旦两个假设都满足，就使用ANOVA和事后Tukey检验进行分析。否则（一个或两个假设未满足），则应用Kruskal–Wallis检验和事后Dunn检验（详见源数据文件）。统计分析中获得的p值显示在柱状图上方；绿色柱状图（用细菌和噬菌体处理的小鸡）标有三个数字，表示与用NaCl处理的小鸡（较低值）、噬菌体（中间值）和细菌（较高值）代表的组的p值；因此，红色和蓝色柱状图分别标有两个和一个p值，分别表示与它们左侧的柱状图结果的比较。当p<0.05时被认为是统计学上显著的差异。方案（a）是使用BioRender.com（发布许可证号AH26HQ0OQ2）创建的。本图所示的详细结果包含在源数据文件中。

鸡细胞通过cGAS和TLR9依赖的过程识别噬菌体DNA

在动物或人类细胞中，有两条主要的病毒DNA识别途径，它们依赖于cGAS或TLR9，并导致IFNβ的产生。因此，我们在所采用的实验系统中检测了这些途径的主要组分的水平。我们发现，尽管在感染了沙门氏菌的鸡的血细胞中，cGAS（细胞质病毒DNA感应器）、IFI16和DDX41的水平升高，但在用噬菌体混合物处理的动物中，它们的水平与对照组相当（见图2b和补充图S2）。当同时给予沙门氏菌和噬菌体时，与单独感染沙门氏菌的动物相比，这些因素的水平显著降低（见图2b和补充图S2）。

然而，不仅感染了沙门氏菌的鸡体内TLR9水平显著增加，即使在没有细菌感染的情况下，给予噬菌体混合物后，鸡体内的TLR9水平也显著增加（见图2a）。这表明噬菌体DNA是通过TLR9受体被识别的。这种可能性得到了证实，发现在同时存在沙门氏菌和噬菌体混合物的情况下，TLR9的水平比单独用细菌或噬菌体处理的鸡更高（见图2a）。正如预期的那样，噬菌体混合物处理的鸡中其他检测的TLR受体（TLR3、TLR4和TLR6）的水平并没有提高，但是感染沙门氏菌导致了这些受体水平的显著增加，而噬菌体的同时存在则降低了甚至纠正了这种增加（补充图S3）。  

在仅用噬菌体混合物处理的鸡的血样中，cGAS和STING（TMEM173）的水平没有升高，但在这些条件下，特定信号核苷酸cGAMP的丰度显著增加（见图2b-d），这表明这一途径也被诱导了。然而，需要注意的是，cGAS和STING的特定水平并不是信号转导过程中的关键，它们的特定活性才是至关重要的。这一点通过IRF3的特别高水平得到了证实，IRF3是该信号转导途径的最终组分（见图2e）。然而，转录因子IRF3在没有磷酸化的情况下无法进入细胞核并激活转录，而在仅用噬菌体混合物处理的鸟类中，这种蛋白质的磷酸化形式的水平非常低（见图2f）。这表明，使用cGAMP作为介导因子的信号转导途径在用噬菌体处理的鸟类的血细胞中被诱导，但在IRF3磷酸化阶段被阻断。通过展示涉及激活IRF3修饰（IKKε、TBK1及其磷酸化形式）的复合体的蛋白（TANK、TBKBP1和NAP1）水平升高，进一步证实了在IRF3磷酸化阶段信号转导途径被特异性抑制（见图3a-f）。

与噬菌体不同，沙门氏菌的存在导致cGAMP、STING、IRF3和磷酸化IRF3的水平增加（见图2c-f）。与单独用沙门氏菌处理的鸡相比，用特定的细菌和噬菌体同时处理导致cGAMP、STING和磷酸化IRF3的水平降低，然而，未修饰的IRF3水平进一步升高（相对于感染细菌的鸟类）（见图2c-f）。这些结果证实了前一段中提出的结论。

 

图2：与TLR9的激活不同，由噬菌体诱导的cGAS-STING信号通路在鸡体内被阻断在IRF3磷酸化阶段，而由S. enterica感染诱导的信号通路则没有被阻断。通过ELISA在图1中指定获得的血液样本中测定了TLR9（a）、cGAS（b）、cGAMP（c）、STING（TMEM173）（d）、IRF3（e）和磷酸化IRF3（f）的水平。结果对应于用NaCl（白色柱状图，圆圈代表个体结果）、噬菌体（蓝色柱状图，正方形）、细菌（红色柱状图，三角形）和细菌及噬菌体（绿色柱状图，倒三角形）处理的小鸡（每种子组n=5）的样本，并且是平均值，误差条代表标准差。对于统计分析，使用Kolmogorov–Smirnov检验检查变量分布的正态性，使用Levene检验检查方差的同质性。一旦两个假设都满足，就使用ANOVA和事后Tukey检验进行分析。否则（一个或两个假设未满足），则应用Kruskal–Wallis检验和事后Dunn检验（详见源数据文件）。统计分析中获得的p值显示在柱状图上方；绿色柱状图（用细菌和噬菌体处理的小鸡）标有三个数字，表示与用NaCl处理的小鸡（较低值）、噬菌体（中间值）和细菌（较高值）代表的组的p值；因此，红色和蓝色柱状图分别标有两个和一个p值，分别表示与它们左侧的柱状图结果的比较。当p<0.05时被认为是统计学上显著的差异。本图所示的详细结果包含在源数据文件中。

Fig. 3: Levels of proteins involved in both cGAS-STING and TLR9/MyD88 signaling pathways are elevated by both bacteriophages and S. enterica infection in chickens. Levels of TBK1 (a), phosphorylated TBK1 (b), IKKε (c), TANK (d), TBKBP1 (e), and NAP1 (f) were determined by ELISA in samples of blood obtained as indicated in Fig. 1. Results correspond to samples obtained from chickens (n = 5 for each subgroup) treated with NaCl (white columns with circles representing individual results), phages (blue columns with squares), bacteria (red columns with triangles), and bacteria and phages (green columns with inverted triangles), and are mean values with error bars representing SD. For statistical analyses, the normality of the distribution of variables was checked with the Kolmogorov–Smirnov test and the homogeneity of the variances with Levene’s test. Once both assumptions were met, the analysis was carried out using ANOVA and post hoc Tukey’s test. Otherwise (one or both assumption(s) was/were not met), the Kruskal–Wallis test and post hoc Dunn test were applied (see the Source Data file for details). The p values obtained in the statistical analyses are indicated above the columns; the green columns (chickens treated with bacteria and phages) are marked with three numbers, indicating p values vs. the groups representing chickens treated with NaCl (lower value), phages (middle values), and bacteria (upper values); consequently, red and blue columns are marked with two and one p value(s), respectively, indicating comparisons with the results shown in columns located to the left of them on the panel. Statistically significant differences were considered when p < 0.05. Detailed results demonstrated in this figure are included in the Source Data file.

在响应噬菌体DNA存在时阻断IRF3磷酸化的机制

鉴于抑制IRF3的磷酸化对于抑制鸡细胞对噬菌体DNA的免疫反应非常关键，我们力求探究这一调控机制背后的分子原理。早期的研究已经证明RNA聚合酶III能够转录细胞质中的DNA，进而合成5'三磷酸双链RNA（dsRNA）。这种dsRNA一旦被RIG-I类受体（RLRs）识别，就会激活适配蛋白（MAVS），并与RLRs协同作用，促进TBK1和IKKε的激活，这是IRF3磷酸化的关键步骤。我们推测噬菌体DNA由于其基因组较短，缺乏类似于真核生物启动子和特定的富AT区域序列，因此不能被RNA聚合酶III有效转录（与此相反，真核病毒含有特定的启动子，而细菌基因组由于足够大，能够包含随机的、类似于RNA聚合酶III特异性启动子的序列）。如果这一假设正确，那么在对噬菌体DNA的反应中，RLRs和MAVS介导的TBK1和IKKε的激活可能无法实现，从而导致IRF3磷酸化过程受阻，以及其无法进入细胞核。  

为了检验这一假设，我们采用了鸡淋巴母细胞（DT40细胞系），将其分别转染了来自vB_SenM-2和vB_Sen-TO17的噬菌体DNA，或者沙门氏菌菌株的基因组DNA（未进行转染的细胞作为阴性对照组）。我们证实，无论是噬菌体基因组还是细菌基因组片段的转染效率都很高，这表明外源DNA能够高效地进入鸡细胞（见图4a）。此外，通过LAL测试确认了所有检测的DNA样本中内毒素的含量都很低。vB_SenM-2、vB_Sen-TO17和沙门氏菌DNA样本的测定值分别为0.87、0.98和0.96 EU/ml，按照标准，每毫升内毒素含量小于1 EU的样本被视为超纯样本。

为了验证培养的鸡淋巴母细胞对噬菌体和细菌DNA的反应是否与感染沙门氏菌或接受噬菌体混合物治疗鸡血中的反应一致，我们利用RT-qPCR技术评估了cGAS、STING和IRF3基因的表达效率。研究结果确认，转染淋巴母细胞中这些基因表达的变化趋势与在鸡血样中相应基因产物水平的变化趋势一致（见图4b）。此外，我们还测量了转染淋巴母细胞中IRF3的磷酸化水平，结果显示，在细菌DNA存在的情况下显著上升，而在噬菌体DNA存在的情况下则没有变化（见图4c）。这些发现表明，在转染的淋巴母细胞中对沙门氏菌基因组DNA和噬菌体DNA的免疫应答与在鸡体内观察到的应答具有可比性。

 

图4：鸡淋巴母细胞对噬菌体和细菌DNA的免疫反应与感染噬菌体或S. enterica的鸡相似。通过PCR确认了鸡淋巴母细胞被来自噬菌体vB_Sen-TO17和vB_SenM-2的DNA，以及来自S. enterica血清型Typhimurium菌株13的DNA转染的效率，使用从转染细胞中分离的DNA进行琼脂糖凝胶电泳（a）（显示代表性的电泳图，其中M泳道包含分子重量标记（左侧显示DNA大小），C+和C−泳道分别表示有和没有纯化的噬菌体/细菌DNA的对照，(+)和(−)分别表示转染和未转染的细胞；每个反应重复3次，结果相同）。通过RT-qPCR测定了鸡淋巴母细胞在用噬菌体或细菌DNA转染24小时后编码IRF3、STING和cGAS的基因的mRNA水平，并显示为相对于未转染细胞的倍数变化（b）。通过ELISA在用噬菌体或细菌DNA转染24小时后的鸡淋巴母细胞裂解物中测定了磷酸化IRF3（c）、磷酸化IRF7（d）、磷酸化NF-κB（e）和磷酸化TBK1（f）的水平。在（b）中，结果对应于用噬菌体或细菌DNA转染的细胞中mRNA水平，相对于未转染的细胞（n=3；独立的生物学重复），并表示为平均值，点显示个别结果，误差条表示标准差。在（c–f）中，结果对应于用NaCl处理（白色柱状图，圆圈代表个体结果）、噬菌体DNA（蓝色柱状图，正方形）和细菌DNA（红色柱状图，三角形）的细胞（n=6；独立的生物学重复）的样本，并且是平均值，误差条代表标准差。对于统计分析（b–f），使用Kolmogorov–Smirnov检验检查变量分布的正态性，并使用Levene检验检查方差的同质性。一旦两个假设都满足，就使用ANOVA和事后Tukey检验进行分析。否则（一个或两个假设未满足），则应用Kruskal–Wallis检验和事后Dunn检验（详见源数据文件）。统计分析中获得的p值显示在柱状图上方。在（b）中，它们表示转染和未转染细胞之间的比较结果。在（c–f）中，柱状图用数字标记，表示与用NaCl处理的细胞（较低值）、噬菌体或细菌DNA（中间值）和时间0（较高值）的p值；因此，特定的柱状图用一个、两个或三个数字标记。当p<0.05时被认为是统计学上显著的差异。本图所示的详细结果包含在源数据文件中。

为了验证RNA聚合酶III在鸡细胞中是否存在噬菌体或细菌DNA时能否合成双链RNA（dsRNA），我们使用了一种特异于dsRNA的抗体。通过荧光显微镜观察转染的细胞以及采用细胞裂解后的点印迹技术来探测特定的信号。在转染了沙门氏菌染色体片段的细胞实验中，无论是荧光显微镜还是点印迹技术，我们都观察到了强烈的dsRNA信号，而未转染的细胞则显示背景水平的信号（见图5a–d）。使用RNA聚合酶III的抑制剂（最终浓度设定为IC50值，这一浓度的选择是为了避免在整个实验过程中细胞生长受到显著抑制）后，dsRNA特异性信号的强度显著下降了约50%，这表明检测到的dsRNA分子主要是由这种RNA聚合酶产生的（见图5a–d）。而在转染了噬菌体DNA的鸡淋巴母细胞实验中，我们得到了不同的结果：在这两种实验中，dsRNA水平并没有显著增加，且含有噬菌体DNA的细胞中的dsRNA含量与未转染的对照细胞相比没有统计学差异（见图5a–d）。这些结果证实了我们的假设：在响应噬菌体DNA时，在IRF3磷酸化的阶段观察到的信号转导的阻断，可能是由于RNA聚合酶III在这些条件下无法合成dsRNA，这很可能是因为噬菌体基因组中缺少可被识别的序列。

 

图5：在用细菌DNA转染后，鸡淋巴母细胞中RNA聚合酶III合成的双链RNA（dsRNA）含量丰富，但在用噬菌体DNA转染后则不丰富。通过荧光显微镜（a，b）或点印迹（c，d），使用特定的抗dsRNA抗体（a–d）和DAPI染色（a），估算了鸡淋巴母细胞在用细菌（S. enterica血清型Typhimurium菌株13）或噬菌体DNA转染24小时后dsRNA的含量。在转染前立即添加了RNA聚合酶III的抑制剂，最终浓度为25μM（接近人酶的IC50值，估计为27μM）。展示了显微照片（a）和印迹（c）的示例，并对100个随机选择的细胞进行了量化分析，重复了3次作为独立的生物学实验（b）或3次独立的点印迹实验（d），并以平均值（来自3个独立实验的值，显示为点）和代表标准差的误差条呈现。对于统计分析（b，d），使用Kolmogorov–Smirnov检验检查变量分布的正态性，并使用Levene检验检查方差的同质性。一旦两个假设都满足，就使用ANOVA和事后Tukey检验进行分析。否则（一个或两个假设未满足），则应用Kruskal–Wallis检验和事后Dunn检验（详见源数据文件）。统计分析中获得的p值显示在柱状图上方。当显示一个数字时，它对应于与对照组的统计分析。当显示两个数字（在用RNA聚合酶III抑制剂处理的DNA转染细胞的实验中），上面的数字对应于与对照组的统计分析，下面的数字对应于与没有抑制剂的类似实验的统计分析。当p<0.05时被认为是统计学上显著的差异。本图所示的详细结果包含在源数据文件中。    

为了探究阻断cGAS-STING信号通路的机制是否仅见于鸡，或者这是一个普遍存在的现象，我们用小鼠脾细胞重复了上文中提到的实验，这些脾细胞被转染了噬菌体或细菌DNA。我们从小鼠身上分离出脾细胞之前，对这些野生型小鼠进行了全面健康检查，以确保它们的健康状况符合标准（见补充表S1）。

我们验证了小鼠脾细胞与鸡细胞相似，在细菌DNA存在时同样增强了IFNα和IFNβ的产生，而当这些细胞被噬菌体DNA转染时，仅产生了IFNβ而非IFNα（见补充图S4）。鉴于小鼠脾细胞被细菌和噬菌体DNA转染的效率与鸡淋巴母细胞相似，并且在小鼠与鸡细胞中，免疫反应相关的关键蛋白质水平的变化也相似（见补充图S5），我们得出结论，哺乳动物和鸟类细胞对细菌和噬菌体DNA的响应具有可比性，包括在噬菌体DNA存在时IRF3磷酸化阶段cGAS-STING信号通路的抑制。因此，我们进一步测试了RNA聚合酶III在小鼠脾细胞中对细菌和噬菌体DNA存在时合成dsRNA的效率。实验结果与鸡淋巴母细胞相似，即在用细菌DNA转染的细胞中有效地合成了dsRNA，而用噬菌体DNA转染的细胞中则没有（见补充图S6）。因此，我们得出结论，鸡和小鼠对噬菌体DNA的免疫响应，包括抑制cGAS-STING信号通路的机制，是相似的。

TLR9和MyD88依赖的信号转导途径负责产生由经噬菌体处理的鸡血细胞产生的INFβ

鉴于鸡细胞对噬菌体DNA的反应中的cGAS-STING信号通路在IRF3磷酸化阶段受到阻断，我们进一步检验了另一条依赖于TLR9受体激活的信号通路的效率（如图2a所示，该受体被噬菌体DNA激活）。在经噬菌体混合物处理的鸡血细胞中，明显观察到这一通路中的多个关键因子，包括MyD88（图6a）、IRAK1（图6b）、IRAK4（图6c）和TRAF6（图6d）的水平显著提升。此外，参与这一信号转导过程的蛋白质，如TBK1（包括其磷酸化形式）和IKKε，以及调控这些激酶的复合体中的因子TANK、TBKBP1和NAP1（图3a–f），其水平也有所提高。这些因子在TLR9/MyD88和cGAS-STING两条信号通路中均有作用。

 

Fig. 6: The TLR9/MyD88 signaling pathway is induced by both bacteriophages and S. enterica infection in chickens.Levels of MyD88 (a), IRAK1 (b), IRAK4 (c), and TRAF6 (d) were determined by ELISA in samples of blood obtained as indicated in Fig. 1. Results correspond to samples obtained from chickens (n = 5 for each subgroup) treated with NaCl (white columns with circles representing individual results), phages (blue columns with squares), bacteria (red columns with triangles), and bacteria and phages (green columns with inverted triangles), and are mean values with error bars representing SD. For statistical analyses, the normality of the distribution of variables was checked with the Kolmogorov–Smirnov test and the homogeneity of the variances with Levene’s test. Once both assumptions were met, the analysis was carried out using ANOVA and post hoc Tukey’s test. Otherwise (one or both assumption(s) was/were not met), the Kruskal–Wallis test and post hoc Dunn test were applied (see the Source Data file for details). The p values obtained in the statistical analyses are indicated above the columns; the green columns (chickens treated with bacteria and phages) are marked with three numbers, indicating p values vs. the groups representing chickens treated with NaCl (lower value), phages (middle values), and bacteria (upper values); consequently, red and blue columns are marked with two and one p value(s), respectively, indicating comparisons with the results shown in columns located to the left of them on the panel. Statistically significant differences were considered when p < 0.05. Detailed results demonstrated in this figure are included in the Source Data file.

TLR9和MyD88依赖的信号传导途径的最终步骤是激活两种转录因子：IRF7和NF-κB。值得注意的是，IRF7通过磷酸化过程被激活，而NF-κB则通过去磷酸化过程被激活，因此，仅有磷酸化的IRF7和未磷酸化的NF-κB能从细胞质迁移到细胞核，并促进特定基因的转录，包括那些编码IFNβ的基因。图7a和b中展示的数据显示，经过噬菌体混合物处理的鸡血液中，IRF7及其磷酸化形式的水平有所增加，这证实了该转录因子的激活确实发生了。此外，尽管在这些条件下NF-κB的磷酸化形式的水平较低（图7c），但其未磷酸化形式在样本中的含量高出许多（图7d）。这些结果表明，IRF7和NF-κB在鸡接受噬菌体混合物处理后被有效激活，进而促进了IFNβ的有效产生。在鸡淋巴母细胞的实验中也观察到了相似的结果（图4d–f），这进一步验证了两种实验体系的一致性。  

鸡在只感染沙门氏菌后，所检测的信号转导通路同样被激活（见图6和图7）。不过，与依赖于cGAS和STING的通路不同，加入噬菌体混合物实际上是增强了宿主对细菌感染的响应，而非对其进行抑制。  

Fig. 7: IRF7 and NF-κB transcription factors are activated after both administration of bacteriophages and S. enterica infection in chickens. Levels of IRF7 (a), phosphorylated IRF7 (b), phosphorylated NF-κB (c), and NF-κB (d) were determined by ELISA in samples of blood obtained as indicated in Fig. 1. Results correspond to samples obtained from chickens (n = 5 for each subgroup) treated with NaCl (white columns with circles representing individual results), phages (blue columns with squares), bacteria (red columns with triangles), and bacteria and phages (green columns with inverted triangles), and are mean values with error bars representing SD. For statistical analyses, the normality of the distribution of variables was checked with the Kolmogorov–Smirnov test and the homogeneity of the variances with Levene’s test. Once both assumptions were met, the analysis was carried out using ANOVA and post hoc Tukey’s test. Otherwise (one or both assumption(s) was/were not met), the Kruskal–Wallis test and post hoc Dunn test were applied (see the Source Data file for details). The p values obtained in the statistical analyses are indicated above the columns; the green columns (chickens treated with bacteria and phages) are marked with three numbers, indicating p values vs. the groups representing chickens treated with NaCl (lower value), phages (middle values), and bacteria (upper values); consequently, red and blue columns are marked with two and one p value(s), respectively, indicating comparisons with the results shown in columns located to the left of them on the panel. Statistically significant differences were considered when p < 0.05. Detailed results demonstrated in this figure are included in the Source Data file.

讨论

噬菌体与真核生物之间的潜在互动问题变得极为重要，鉴于这些病毒是地球上最丰富的生物实体，它们在人类和动物肠道中大量存在，并且可能用于对抗细菌感染（这是对一个世纪前原始发现的再次确认）。尽管噬菌体是细菌的专性寄生体，但最新的研究提供了证据，表明它们不仅能够影响人类和动物肠道的微生物组成，还能够对真核宿主的免疫系统产生影响。

显然，噬菌体衣壳蛋白与任何进入人体或动物体内的外来蛋白一样，能够引发适应性免疫反应。然而，噬菌体可能还会诱发抗病毒免疫反应，这一点颇为出人意料。这一发现在专门针对铜绿假单胞菌的丝状噬菌体Pf的研究中得到了体现。这种噬菌体携带单链DNA基因组，能够影响其细菌宿主的毒力和抗生素抗性。它可以通过哺乳动物细胞的内吞作用进入细胞内，导致噬菌体源性RNA分子的产生，这些分子能被TLR3受体识别，从而触发产生I型干扰素的信号通路。  

除了TLR3能够识别噬菌体RNA外，TLR9也能识别源自噬菌体基因组的DNA，因为TLR9能识别未甲基化的CpG序列，这些序列在噬菌体基因组以及感染人类/动物细胞的病毒和细菌基因组中普遍存在。尽管如此，人类/动物细胞通过TLR9途径响应噬菌体DNA的分子机制仍然不是非常清楚。据我们所知，依赖于感知细胞质DNA的抗病毒反应第二大系统——cGAS-STING依赖途径对噬菌体DNA的识别，之前在文献中从未被报道过。因此，我们的目标是探究动物细胞识别噬菌体的机制，特别是通过上述两个主要途径：TLR9/MyD88和cGAS-STING系统。这些研究是在之前建立的鸡模型中进行的，该模型涉及感染或未感染沙门氏菌的鸡只，以及它们是否接受了针对该细菌的两种噬菌体（具有双链DNA基因组）的混合物处理。这些研究得到了这样一个事实的支持：在给鸡施用噬菌体混合物后，检测到IFNβ的产生增强，而IFNα、IFNγ或TNFα的产生并没有增强（见图1）。

虽然噬菌体DNA的存在并没有提高cGAS的水平，但显然在这些条件下，信号核苷酸cGAMP被有效产生（见图2）。然而，对于cGAMP的合成来说，cGAS的活性（由DNA结合激活）比其表达水平更为关键。因此，这是首次证实在向动物施用噬菌体后，cGAS-STING系统被激活。这一结论得到了IRF3水平显著升高的支持（见图2），IRF3是一种转录因子，它促进编码IFNβ和其他细胞因子的基因表达。然而，在用噬菌体处理的鸡血细胞中，IRF3的磷酸化水平却很低，表明IRF3的磷酸化过程受到了阻碍。因此，我们推测，被鸡细胞内化的噬菌体DNA可能被cGAS-STING系统感知，但是信号转导途径中的关键步骤——IRF3的磷酸化——被阻断了，这妨碍了完整的抗病毒反应的进行。  

因此，我们的目标是阐明，在噬菌体DNA激活cGAS-STING通路时，IRF3激活受损的机制是什么，这与在动物细胞内复制的病毒或像沙门氏菌这样的细菌病原体所引起的完全有效的激活相反，如本报告（见图2）所示。这一机制可能特别引人入胜，因为在接受了噬菌体混合物处理的鸡血细胞中，TBK1及其磷酸化形式，以及对IRF3磷酸化至关重要的激酶IKKε的水平都有所增加（见图3）。此外，激活这些激酶复合体中所包含的蛋白质，如TANK、TBKBP1和NAP1，也观察到了类似的效应（见图3）。

一种可能的解释是，与感染真核细胞的病原体不同，噬菌体无法在这类宿主中繁殖，因为它们的基因组中存在的调控序列无法被特定的真核酶识别。正如之前所展示的，在线性DNA感受器（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）途径中，RNA聚合酶III转录细胞质DNA以产生双链RNA（dsRNA），这种dsRNA被RIG-I类受体（RLRs）识别。这是一个刺激它们的适配蛋白MAVS的信号。重要的是，RLRs和MAVS是激活TBK1和IKKε所必需的。因此，我们假设噬菌体DNA不能被RNA聚合酶III有效转录，因此RLRs-MAVS激活TBK1和IKKε是无效的，导致IRF3磷酸化及其随后转移到细胞核的能力受损。尽管早期报告和最近的研究表明噬菌体DNA衍生的转录物出现在真核细胞中，但这些RNA很可能是由偶然识别的类启动子序列随机转录的产物，也许是由真核RNA聚合酶之一所催化。由RNA聚合酶III催化的转录，导致形成激活RLRs-MAVS系统的RNA物种，需要DNA模板中存在特定的富含AT的序列。此外，它还需要TATA结合蛋白（TBP），这是一个与RNA聚合酶III协同作用并负责其特异性的转录因子。事实上，在天然DNA来源中，腺病毒和单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的双链DNA基因组，以及嗜肺军团菌（一种人类细菌病原体）的基因组片段，可以诱导RLRs依赖性反应，而各种合成DNA（缺乏富含AT的区域）以及小牛胸腺DNA，则未能激活IRF3和诱导IFNβ的产生。  

我们怀疑噬菌体DNA可能很难被RNA聚合酶III识别，尤其是由于其紧凑的性质，缺乏富含AT的序列，以及噬菌体启动子演化为被细菌RNA聚合酶而非真核转录因子识别的事实。我们通过将鸡淋巴细胞分别转染噬菌体DNA或沙门氏菌染色体片段，并监测双链RNA（dsRNA）分子的出现来验证这一假设。只有在转染了细菌DNA的淋巴细胞中才能观察到来自dsRNA特异性抗体的强烈信号，而转染噬菌体DNA的细胞则没有（在后一种情况下，信号与未转染细胞中观察到的背景水平相同）（见图4和图5）。在RNA聚合酶III抑制剂存在的情况下，dsRNA特异性信号的出现受到损害，进一步证实了我们测试的假设（见图5）。因此，我们得出结论，真核RNA聚合酶III在噬菌体DNA模板上有效产生5′三磷酸dsRNA的能力是不充分的，最终导致cGAS-STING途径在最后一步（IRF3的磷酸化）被阻断。当小鼠脾细胞分别转染细菌或噬菌体DNA并检测dsRNA分子的存在时，得到了相同的结果，表明我们提出的解释并不特定于鸡细胞，而可能普遍适用于哺乳动物和鸟类的免疫系统（见补充图S5和S6）。因此，我们提出的机制可以解释真核细胞对噬菌体DNA存在特定抗病毒反应的阻断。  

与细胞质DNA感受器的cGAS-STING途径不同，依赖于TLR9/MyD88的途径在吞噬作用中被外来DNA激活，似乎能被噬菌体DNA完全激活。我们观察到在这个系统中运作的所有关键因素都被刺激了（见图2和图3），以及两个参与编码IFNβ基因表达的转录因子的激活，即IRF7的磷酸化和NF-κB的去磷酸化（见图4和图7）。这导致了IFNβ的有效产生（见图1e）。

噬菌体诱导的IFNβ产生被发现伴随着抗炎细胞因子（IL10和IL4）水平的升高，但并没有促炎白细胞介素的增加。实际上，IFNβ已被证明可以刺激IL10的产生，并且这一活性的重要性也被讨论过。这可能解释了动物和人类在接受噬菌体治疗时缺乏强烈的炎症反应。

对鸡进行噬菌体混合物处理的研究结果得到了沙门氏菌感染实验的证实，以及感染和噬菌体治疗实验的支持。正如预期的那样，鸡的细菌感染有效地诱导了研究中的两条途径，即cGAS-STING途径和TLR9/MyD88依赖途径。看来，沙门氏菌的DNA可能和军团菌一样，对RLRs-MAVS系统的激活同样有效，从而允许IRF3的磷酸化和特定反应的诱导。由于IRF3调节着包括免疫反应中涉及的基因在内的数千个基因的表达，因此正反馈现象可能导致上述系统中许多因子的水平进一步增加，而仅施用噬菌体时并非如此。此外，与噬菌体治疗相反，沙门氏菌感染不仅诱导了TLR9，还诱导了其他TLRs，如TLR3、TLR4和TLR6（补充图S3）。用噬菌体混合物处理感染了沙门氏菌的鸡，导致cGAS-STING途径受损和TLR9途径的刺激。然而，目前尚不清楚这种噬菌体对细菌感染的动物反应的调节是由于特定噬菌体消除了沙门氏菌，正如之前所证明的29，还是由于这些原核病毒对动物免疫系统的独立影响。   展示噬菌体DNA通过cGAS-STING途径不引起强烈抗菌免疫反应的分子机制，以及在噬菌体DNA存在下记录的抗炎细胞因子的产生，可以解释之前描述的噬菌体给动物使用的安全性。这对于将噬菌体疗法引入兽医医学领域可能很重要。值得一提的是，噬菌体可能被视为饲料添加剂或治疗剂的使用。欧盟和欧洲药品管理局最近的法规定义了这两种潜在应用的要求。根据2003年9月22日欧洲议会和理事会关于动物营养添加剂的法规（EC）No. 1831/2003，噬菌体作为饲料添加剂（添加剂）的批准是可能的。然而，2023年10月23日，欧洲药品管理局的法规EMA/CVMP/NTWP/32862/2022对噬菌体疗法的兽药产品质量、安全性和有效性指南生效。这些要求比饲料添加剂的要求严格得多，更难满足，包括安全问题。因此，像本报告中描述的工作这样的研究很重要，它们可能导致批准使用噬菌体来预防或治疗动物对细菌感染。