港中大毛传斌Nature Nanotechnology：基因工程改造噬菌体纳米纤维用于肿瘤靶向免疫治疗

免疫疗法是一种新兴的治疗癌症的有效手段。该治疗方法的核心思想是切断癌细胞的免疫抑制机制，使患者自身的免疫系统能够恢复对癌细胞的杀伤能力，从而自发地清除肿瘤组织。目前较成熟的免疫疗法是阻断癌细胞免疫抑制机制中的 PD-1/PD-L1 轴。癌细胞表面常常过表达大量的 PD-L1 蛋白。当T细胞上的 PD-1 蛋白与癌细胞表面的 PD-L1 蛋白结合，T细胞的活性下降而不发挥杀伤癌细胞功能。使用 PD-L1 抗体药物阻断癌细胞表面的 PD-L1，即可恢复肿瘤部位的免疫反应。然而，一些非肿瘤细胞表面也表达 PD-L1 蛋白，而且现在市面上常用的 PD-L1 抗体药物的肿瘤靶向性较差，可能导致非肿瘤部位的免疫反应被激活，引起难以控制的副作用，如全身肌肉疼痛、免疫性肺炎、免疫性肠炎、免疫性肝炎和免疫心肌炎等。此外，PD-L1 抗体药物的疗效和适用性也因人而异。

香港中文大学毛传斌教授团队通过引入fd丝状噬菌体来解决上述问题，相关成果于2024年10月发表在国际著名学术期刊Nature Nanotechnology（IF: 38.1），题目为“Filamentous phages as tumour-targeting immunotherapeutic bionanofibres”。毛传斌教授是噬菌体科学领域全球顶尖学者，曾先后当选为英国皇家化学会（RSC）会士、美国医学和生物工程院（AIMBE）会士、美国科学促进会（AAAS）会士、美国微生物科学院（AAM）会士、美国化学会（ACS）会士、美国生物医学工程学会（BMES）会士、美国化学会高分子材料科学与工程委员会（PMSE）会士、国际医学与生物工程院（IAMBE）和香港工程师学会（HKIE）会士。

图1. 双功能丝状噬菌体fd-HH-IP抑制小鼠黑色素瘤生长的示意图。a，利用 Ph.D.TM-7 噬菌体展示文库进行体外筛选，获得与 PD-L1 结合的肽 (HH)。b，采用体内外结合的筛选策略，通过 Ph.D.TM-12 噬菌体文库获得特异性靶向黑色素瘤的肽 (IP)。c，构建双功能噬菌体 fd-HH-IP，其中 IP 融合表达于噬菌体末端 pIII 衣壳蛋白（5 拷贝），HH 融合表达于噬菌体侧壁 pVIII 衣壳蛋白（约 3,900 拷贝）。d，fd-HH-IP 噬菌体通过尾静脉注射入黑色素瘤小鼠体内，靶向肿瘤细胞并与其表面的 PD-L1 蛋白结合，阻断 PD-1/PD-L1 相互作用，避免免疫逃逸，激活 T 细胞反应，最终抑制肿瘤生长。

通过新型噬菌体体外筛选技术，获得结合 PD-1/PD-L1 作用位点的多肽序列HH，通过实验验证序列HH 可以有效阻断 PD-1 和 PD-L1 的相互作用，并获得多肽与 PD-L1 蛋白最可能的结合模型。然后将 PD-L1 抗体药物、多肽药物和噬菌体药物通过瘤内注射的方式分别给药，通过常规检测观察三类药物抑制肿瘤生长的效果，并通过细胞因子检测、免疫荧光染色和细胞流式等试验，评价其免疫治疗疗效。结果显示，亲和序列HH 可以有效阻断 PD-1/PD-L1 结合，激发免疫反应，抑制肿瘤的生长；且亲和噬菌体的肿瘤免疫疗效优于亲和多肽的效果，表明丝状噬菌体有望成为一种新型的免疫抑制剂材料。

图2. 从噬菌体展示随机肽库中发现 PD-L1 结合序列。a，获取与 PD-1 竞争结合 PD-L1 的新型多肽序列。b，三轮生物筛选中的噬菌体输出。c，ELISA 测量三种高频噬菌体（Ph-HH、Ph-LN 和 Ph-WG）、一个未选择序列（Ph-WF）、一个对照噬菌体（WT）和 PBS 对照组与 PD-L1 的相互作用。d，PD-1蛋白与 PD-L1蛋白结合的模型（i）以及多肽 HH与 PD-L1蛋白结合的模型（ii）。e，f，CCK-8 测定不同浓度肽（e）和噬菌体（f）处理 B16-F10 细胞的存活率。g，罗丹明 B 标记肽（HH、LN 和 WG）与肿瘤细胞表面结合的免疫荧光成像。比例尺，50 μm。h，TR-FRET 测定噬菌体对 PD-1/PD-L1 结合的抑制作用。

通过细胞和体内交替筛选技术，获得黑色素瘤靶向肽序列IP。通过基因编辑技术，将上述 PD-L1 亲和肽和黑色素瘤靶向肽的相应基因插入fd 噬菌体侧壁蛋白（pVIII）和尖端蛋白（pIII）的基因中，将二者分别展示在其侧壁和尖端。由此产生的双功能fd 噬菌体具有生物相容性，可以有效结合黑色素瘤细胞，并阻断 PD-1/PD-L1 的相互识别，激活免疫反应，从而有效抑制肿瘤生长。噬菌体可以通过感染宿主细菌进行扩增，从而得以低成本大量生产。且展示在噬菌体侧壁或尖端的多肽可以被替换为靶向其他信号通路或癌细胞的多肽，因此噬菌体有望成为癌症靶向免疫治疗剂的通用平台。

图3. 从噬菌体库中发现黑色素瘤靶向肽并构建双功能噬菌体。a，结合体内和细胞生物淘选方法，从 Ph.D.-12 噬菌体库中生物淘选黑色素瘤靶向噬菌体。b，噬菌体输入输出比（O/I）。c，用RELIC/INFO计算的子库信息含量分布曲线（红色，子库；黑色，原始库）。d，WT噬菌体（i）和双展示噬菌体（ii）的TEM图片。比例尺，500 nm。e，双展示噬菌体在黑色素瘤C57BL/6小鼠中的生物分布。f，与噬菌体孵育的B16-F10细胞在不同噬菌体浓度下的细胞活力（i）和不同孵育时间下的细胞增殖（ii）。g，双展示噬菌体的溶血试验。与噬菌体（WT、fd-GGIP、fd-HH-NL、fd-HH-IP）、PBS和H2O孵育的血液的图像（i）和统计溶血结果（ii）。

图4. 双展示噬菌体对黑色素瘤的靶向免疫治疗。a，双展示噬菌体在 B16-F10 模型中的靶向免疫治疗的给药方案。b，小鼠照片。c，小鼠肿瘤照片。d，肿瘤重量。e，不同治疗组肿瘤体积增长曲线。f，小鼠体重随治疗时间的变化。g–i，各组血清中TNF（g）、IFN-γ（h）和IL-2（i）细胞因子水平。j，肿瘤组织的H&E染色。比例尺，100 μm。k，用染料标记的CD8（红色）和CD4（绿色）抗体染色的肿瘤免疫荧光图像。比例尺，100 μm。(i) PBS、(ii) WT 噬菌体、(iii) fd-GG-IP、(iv) fd-HH-NL、(v) fd-HH-IP  和 (iv) a-PD-L1 组。

该论文的主要创新在于，通过噬菌体展示技术筛选获得新型 PD-L1 亲和肽和黑色素瘤靶向肽，将二者通过基因工程技术分别展示在丝状噬菌体的背部和端部，以这种工程化的噬菌体纳米纤维作为靶向递送载体将 PD-L1 亲和肽运送到肿瘤部位，阻断 PD-1/PD-L1 结合，进而抑制肿瘤生长。其免疫治疗效果可媲美 PD-L1 抗体组治疗效果，同时降低由于抗体对肿瘤靶向性差引发的全身免疫副作用，并具有一定的经济价值和临床转化指导意义。

参考文献

Yue, H.; Li Y.; Yang, T.; Wang, Y.; Bao, Q.; Xu, Y.; Liu, X.; Miao, Y.; Yang, M.; Mao, C. Filamentous phages as tumour-targeting immunotherapeutic bionanofibres. Nature Nanotechnology, 2024, DOI: 10.1038/s41565-024-01800-4.

原文链接https://www.nature.com/articles/s41565-024-01800-4