利用重组报告基因噬菌体对肺炎克雷伯菌进行快速检测和实时抗生素敏感性检测

肺炎克雷伯菌(Kp)作为共生菌普遍存在，存在于胃肠道微生物群、呼吸道和皮肤中。作为一种兼性病原体，Kp可引起多种严重的疾病，例如肺炎、败血症、伤口和尿路感染 （UTI）。近年来，社区获得性Kp引起的肺炎和脑膜炎病例数量急剧增加。随着针对广谱抗生素 （AB） 的获得性 MDR 的出现和细菌的天然耐药机制，Kp感染的治疗已成为一项全球性的医疗保健挑战。

对碳青霉烯类抗生素耐药的Kp感染与严重症状和高死亡率有关。因此，快速诊断感染和检测耐药标志物对患者生存至关重要。鉴定碳青霉烯类耐药 Kp 的经典方法依赖于细菌细胞培养和随后的生化分析，因此仅在几天后提供结果。虽然基于核酸的工具能够快速、特异性地检测病原体，但已建立的检测方法主要针对碳青霉烯类耐药基因，因此无法区分活细胞和样品中存在的 DNA 残基。

这项研究对最近鉴定的 Kp K64 特异性噬菌体 vB_KpP_TUN1 （TUN1） 进行了基因工程改造，并构建了重组 TUN1 报告噬菌体 （rTUN1：：nLuc），用于快速检测细菌细胞培养物中的Kp K64 菌株或直接从临床相关基质中检测，以及用于进行实时抗生素敏感性检测。

图1 TUN1 报告基因噬菌体构建示意图

从合成噬菌体基因组中成功重启 TUN1 需要环化 DNA。为了构建 TUN1 报告噬菌体，所有合成的 DNA 片段 （F1-5_1） 均被扩增，连续片段之间的末端重叠（以匹配的颜色表示）。浅橙色点描绘了 F1 和 F5 与 F5_1 的融合位点，从而实现了合成噬菌体基因组的环化。体外 DNA 组装后，使用环状 DNA 转化大肠杆菌细胞，其中重组噬菌体被重新启动。裂解细胞以从噬菌体不敏感宿主中释放病毒粒子，裂解物用于感染 Kp。接下来，重组噬菌体在其宿主 Kp 中体内扩增，在细菌的草坪上形成噬菌斑。通过测量添加发光底物后的斑块发光来筛选功能性报告噬菌体。

本文能够将 TUN1 基因组最小化高达 4.3% （TUN1 Δhpgc123），同时， 证明假设基因 gp2-4 、 gp7-8 和 gp10-11 对于 TUN1 的成功裂解周期不是必需的。使用基因组还原的 TUN1 Δhpgc2 作为模板，成功插入 RBS-nLuc 报告基因构建体。所得的发光报告噬菌体 rTUN1：：nLuc 能够对 Kp K64 细胞进行特异性和灵敏的检测，每孔的检测限 （LOD） 仅为 1 个 CFU，此外，利用该报告噬菌体能够快速检测血液和尿液样本中的 Kp 细胞，没有基质效应，如荧光素酶淬灭或背景发光的非特异性增加。

本文的结果清楚地证明了报告噬菌体的巨大诊断能力。然而，为了直接从临床样本（例如患有 UTI 的患者的尿液）中广泛适用，不仅需要为所有局部发生的 Kp K-型构建报告噬菌体，还需要为所有临床相关的病原体构建报告噬菌体。这样不仅可以在几个小时内从未知样本中快速识别引起感染的细菌菌株，还可以同时生成引起感染的菌株的实时抗菌谱，以及选择噬菌体治疗的潜在候选菌株。

参考来源：Braun P, Raab R, Bugert JJ, Braun S. Recombinant Reporter Phage rTUN1::nLuc Enables Rapid Detection and Real-Time Antibiotic Susceptibility Testing of Klebsiella pneumoniae K64 Strains. ACS Sens. 2023 Feb 24;8(2):630-639. doi: 10.1021/acssensors.2c01822. Epub 2023 Jan 31. PMID: 36719711; PMCID: PMC9972469.