CRISPR/Cas9介导的T4噬菌体基因组编辑用于高通量抗菌药物敏感性检测

准确有效地测定抗菌素耐药性对于限制传染病传播和确保人类健康至关重要。本研究旨在建立一种简单、准确、高通量的噬菌体比色检测方法。

利用CRISPR/Cas9系统，对T4噬菌体基因组进行模块化改造，使其携带编码β-半乳糖苷酶(β-gal) α-片段的标记基因lacZ-α (lacZa)。_T4lacZa噬菌体通过蓝白选择鉴定，然后用于生物传感应用。如图1所示，细菌溶液暴露于_T4lacZa噬菌体，导致目标细菌过度表达β-gal。在添加比色底物后，β-gal启动酶促反应，导致溶液颜色从黄色变为红色。这种传感策略提供了一种可视化的方法来监测抗生素存在下的细菌生长，从而确定细菌的抗菌药物敏感性。作为概念验证，开发的传感策略成功地用于鉴定尿液样本中9种不同的多重耐药大肠杆菌（E. coli），特异性为100%。与传统的圆盘扩散药敏试验相比，基于噬菌体的基因工程检测策略可在不损失检测灵敏度的情况下将检测时间缩短至少一半，为AST的临床诊断提供了一种高通量的替代方法。

图 1 CRISPR/ cas9介导的T4噬菌体基因组编辑用于细菌比色检测。 (1)通过CRISPR/Cas9系统转染lacZa基因，构建T4WT噬菌体。同时含有Cas9质粒和供体质粒的大肠杆菌在体内表达Cas9/ sgRNA复合物。在噬菌体感染过程中，噬菌体基因组被Cas9/sgRNA复合物切割，然后触发破碎的噬菌体基因组与供体质粒同源臂之间的同源重组，产生重组噬菌体（T4lacZa噬菌体）。(2)利用T4lacZa噬菌体进一步检测细菌。T4lacZa噬菌体感染引发噬菌体繁殖和β-半乳糖苷酶（β-gal）的过表达。随后，T4lacZa噬菌体和β-gal在细胞裂解时被释放。(3)检测信号是在β-半乳糖与氯酚红-β- d-半乳糖苷（CPRG）的酶促反应下产生的。检测结果可通过比色信号确定。

参考文献：CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing of T4 Bacteriophage forHigh-Throughput Antimicrobial Susceptibility Testing.