一种肠球菌噬菌体蛋白抑制参与抗噬菌体防御的IV型限制性酶

本研究深入探讨了肠球菌（Enterococcus faecalis）中的一种噬菌体蛋白如何抑制参与抗噬菌体防御的第四型限制酶（TIV-RE）。研究团队通过CRISPR干扰（CRISPRi）筛选技术，鉴定了一个位于肠球菌可移动质粒上的遗传位点，该位点编码一个假定的丝氨酸重组酶和一个TIV-RE，研究表明这个TIV-RE限制了噬菌体phi47在万古霉素抗性E. faecalis中的复制。进一步研究发现，phi47通过在TIV-RE抑制蛋白中获得一个错义突变来克服这种限制，这个抑制蛋白被命名为TIV-RE抑制因子A（tifA），能够结合并失活多种TIV-REs。

研究结果揭示了E. faecalis利用可移动的抗噬菌体系统来抵抗噬菌体感染，而噬菌体通过共同进化的小开放阅读框来逃避这种限制。研究团队通过对E. faecalis V583和V19两个菌株的比较，发现它们在基因组序列上高度相似，但在它们携带的自然质粒上存在显著差异。通过感染实验，作者发现V19（V583的质粒剔除衍生株）能够支持phi47的复制，而V583则不能，表明V583的某个质粒赋予了对phi47感染的抗性。进一步的实验表明，pTEF2质粒足以抑制phi47的复制，而pTEF1和pTEF3质粒则没有这种效果。

通过CRISPRi基因敲减筛选，作者发现pTEF2上独特的14个开放阅读框（ORFs）中的EF_B0058和EF_B0059与phi47的限制有关。通过单基因敲除实验，确认了EF_B0059是唯一赋予对phi47感染抗性的基因。EF_B0059与EF_B0058编码在一个mRNA上，且EF_B0059属于GmrSD样的TIV-RE家族，具有N端DUF262和C端DUF1524结构域。异源表达实验表明，EF_B0059对含有修饰DNA的大肠杆菌XL1-Blue具有毒性，但对缺乏甲基转移酶的ER2796大肠杆菌株也具有毒性，表明EF_B0059可能不需要修饰的噬菌体DNA来进行限制。通过质谱分析phi47 DNA，作者发现phi47 DNA由未修饰的核苷酸组成，进一步支持了EF_B0059通过修饰独立机制限制噬菌体复制的观点。

研究还发现，噬菌体phi47能够通过在orf65基因中获得一个单点突变来克服EF_B0059的限制。这个突变导致了一个氨基酸从亮氨酸变为苯丙氨酸（L32F），使得Orf65蛋白（现在称为TifA）能够与EF_B0059结合并失活它。通过Alphafold2预测的Orf65结构模型，作者发现Orf65是一个由两个球状结构域通过短连接链连接的小蛋白。尽管Orf65与已知结构的蛋白整体相似性较低，但N端结构域与几个真核蛋白的SH3结构域有一定的结构相似性。Orf65表面带有异常高的酸性残基，导致其具有大的电子负性表面电位，这与T7噬菌体的抗限制蛋白Ocr相似，后者通过模仿B-DNA的结构来结合并失活I型限制酶。

通过在大肠杆菌中异源共表达EF_B0059与野生型Orf65或Orf65L32F变体，作者发现只有Orf65L32F变体能在与EF_B0059共表达时恢复大肠杆菌的生长，表明Orf65L32F能够抑制EF_B0059的活性。免疫共沉淀实验进一步证实了Orf65L32F与EF_B0059之间的物理相互作用，并且这种相互作用是特异的。作者还发现，Orf65L32F的抑制活性可能与其对EF_B0059的结合亲和力增强有关，而野生型Orf65与EF_B0059的相互作用不足以抑制其毒性。

此外，研究还发现Orf65蛋白代表了一类噬菌体编码的蛋白，这些蛋白能够抑制TIV-REs。通过对enterococcal噬菌体基因组中Orf65同源物的序列比较，发现在E. faecalis噬菌体SDS2中，Orf65的第32位自然存在苯丙氨酸，这表明与phi47相关的噬菌体可能已经进化出克服EF_B0059限制的能力。实验结果表明，Orf65能够与EF_B0059同源蛋白GC1503形成复合物，并在一定程度上抑制其活性。这些发现表明，Orf65蛋白在抑制TIV-REs方面具有广泛的活性，并且能够与多种TIV-REs形成复合物。

最后，作者提出了Orf65（TifA）作为一种新型的抗TIV-RE因子，它通过直接结合TIV-REs来抑制其活性。这一发现不仅增进了我们对耐药肠球菌中噬菌体防御机制的理解，还为噬菌体如何进化以克服这些防御系统提供了机制上的见解。这对于噬菌体疗法的实际应用具有重要意义，因为它揭示了噬菌体和细菌之间共同进化的复杂性，并为设计更有效的噬菌体疗法提供了潜在的靶点。

文章来源：https://doi.org/10.1038/s41467-024-51346-1