嗜淀粉欧文氏菌噬菌体大规模生产的优化

欧文氏菌

由解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）引起的火疫病对全球农业构成了重大威胁，而抗生素耐药菌株的出现则迫切需要诸如噬菌体疗法等替代解决方案。将噬菌体疗法推广到工业级别需要高效的批量生产方法，特别是在优化种子培养过程方面。

接种物浓度对噬菌体产生的影响

实验使用了三种噬菌体（pEa_8、pEa_27、pEa_31）来研究接种浓度对产量的影响。随着接种浓度的降低，噬菌体产量呈现增加趋势。在3至6 Log PFU/mL的接种浓度范围内，所有噬菌体的产量均有所增加，且这一增加具有统计学显著性（p < 0.05）。在最低接种浓度（3 Log PFU/mL）时，观察到最高的噬菌体产量。因此，在后续实验中采用了3 Log PFU/mL的接种浓度。

培养基补充对噬菌体产生的影响

实验评估了培养基补充物对噬菌体产量的影响，采用了特定的细菌浓度和噬菌体接种浓度。测试的碳源包括甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇。所有噬菌体在添加补充物后产量均有所增加。对于pEa_8，果糖、蔗糖和山梨醇导致产量显著增加。pEa_27在添加果糖、甘油、山梨醇和蔗糖后产量大幅增加，其中果糖和蔗糖的效果最为显著。pEa_31在添加果糖、山梨醇和蔗糖后产量也显著增加。由于果糖和蔗糖在所有噬菌体中均表现出最显著的效果，因此选择这两种补充物进行后续实验。

研究了CaCl₂和MgCl₂两种阳离子对噬菌体产量的影响。对于pEa_8，CaCl₂和MgCl₂均显著降低了噬菌体产量。CaCl₂导致pEa_27和pEa_31的噬菌体产量分别下降了71%和15%。MgCl₂增加了pEa_27和pEa_31的噬菌体产量，增幅分别为201%和60%。尽管MgCl₂在某些噬菌体中表现出正面效果，但由于阳离子对至少一种噬菌体的产量具有负面影响，因此决定在后续研究中排除它们。

基于响应面法的噬菌体产量培养基补充优化

使用基于CCD（Central composite design）的RSM（Response surface methodology）研究了选定培养基补充物对噬菌体产量的影响。通过ANOVA建立了噬菌体产量与果糖和蔗糖浓度之间的关系。确认了模型的显著性，p值<0.05，F值较高。图1显示了最优因子范围的二维等高线图，用于指导后续实验。确定了pEa_8、pEa_27和pEa_31的最高噬菌体产量的最优浓度范围。对于pEa_8，较低浓度的果糖和蔗糖导致更高产量。对于pEa_27，果糖与产量负相关，蔗糖无显著影响。对于pEa_31，果糖和蔗糖均与产量正相关。确定了最高噬菌体产量的最优果糖和蔗糖浓度，用于后续培养基补充。

图1：响应面2D等值线图显示了糖对嗜淀粉欧文氏菌噬菌体产生的影响

优化噬菌体生产条件的验证

评估了果糖和蔗糖与优化噬菌体浓度相结合的效果。使用传统方法（conventional method，CM）作为对照。在优化条件下，接种物优化（inoculum optimization，IO）的产量有所降低，但添加补充物后产量增加。pEa_27、pEa_47、Fifi318和Fifi451的产量在添加补充物后均有所提高。Fifi451的产量提升最为显著。组合优化策略有效提高了噬菌体产量，达到了与传统方法相当或更高的水平。

发酵罐规模噬菌体生产的优化

优化后的噬菌体生产过程从烧瓶规模应用到发酵罐规模。细菌培养物浓度和噬菌体接种浓度分别设定为特定值。使用模型噬菌体pEa_27测试了发酵罐规模的其他条件。比较了不同pH值对噬菌体产量的影响。维持在pH 6时，噬菌体产量显著提高38%。在pH 5、7和8下，噬菌体产量相比对照有所下降。增加溶解氧对噬菌体产量有下调作用，但差异不显著。确定将pH维持在6作为优化噬菌体生产的额外条件。

发酵罐规模大规模生产条件的验证

使用四种噬菌体（pEa_27、pEa_47、Fifi318和Fifi451）验证了发酵罐规模大规模生产的可行性。细菌浓度和噬菌体浓度分别设定为特定值，并向发酵罐中添加了果糖和蔗糖。将未调整pH值的对照组与维持在pH 6的组进行了比较。所有组的噬菌体产量与对照组相比均有显著增加。在优化设置的基础上增加pH 6条件后，四种噬菌体的产量均有不同程度的提高。

结论

综上所述，本研究证明了优化噬菌体生产在农业应用中的潜力，特别是在控制由解淀粉欧文氏菌（E. amylovora）引起的火疫病方面。通过显著减少接种量（细菌减少1000倍，噬菌体减少10000倍），采用响应面法（RSM）优化培养基补充物，并使用先进的发酵罐技术，研究者实现了与传统方法相当的噬菌体生产产量。研究结果表明，在优化条件下，噬菌体生产可以高效地达到可商业化的浓度（^{1010 PFU/mL}），并且在宿主细胞生长的最佳pH水平下观察到最高产量。该模型的通用性在我们噬菌体库中的不同噬菌体（Fifi318、Fifi451、pEa_SNUABM_27和pEa_SNUABM_47）上得到了验证，这表明其具有广泛的适用性。然而，要完善大规模噬菌体生产，特别是确保在处理如解淀粉欧文氏菌这类对植物致命的病原体时的生物安全性，还需要进一步的研究。总体而言，本研究为开发经济高效且可扩展的噬菌体生产策略奠定了基础，这些策略有助于可持续农业实践并减少对抗生素的依赖。

参考文献：

1.  Jo SJ, Giri SS, Lee SB, Jung WJ, Park JH, Hwang MH, Park DS, Park E, Kim SW, Jun JW, Kim SG, Roh E, Park SC. Optimization of the large-scale production for Erwinia amylovora bacteriophages. Microb Cell Fact. 2024 Dec 23;23(1):342. doi: 10.1186/s12934-024-02607-7. PMID: 39710718.