牛病毒性腹泻病毒（BVDV）作为全球牛群的重大病原体，可引发腹泻、发热、流产等多种病症，在欧洲、南美、北美、非洲及亚洲等主要养牛地区均有高流行率，我国部分奶牛场近年也出现犊牛严重腹泻与高死亡率案例，给养牛业造成显著经济冲击。此前研究已知，BVDV的非结构蛋白NS3在不同病毒亚型中高度保守且具有强免疫原性，是诊断与疫苗研发的核心靶点，但针对其B细胞表位的精准鉴定仍有待突破。

图 1 NS3蛋白及NS3单克隆抗体的鉴定

研究团队首先构建原核表达载体，在大肠杆菌中成功表达并纯化出BVDV NS3重组蛋白，随后以此为抗原免疫Balb/c小鼠，通过细胞融合与有限稀释筛选，获得3株特异性识别NS3蛋白的单克隆抗体（2F7、3E8、4D6）。

图 2 BVDV单克隆抗体的鉴定

经鉴定，这3株抗体亚型明确（2F7为IgG1，3E8、4D6为IgG2a），且均具有高亲和力与高效价，仅与BVDV反应，不与牛疱疹病毒1型等其他常见牛病毒交叉反应，为后续研究奠定了高质量工具基础。

图 3 鉴定表位中的关键氨基酸

通过截短肽筛选与丙氨酸扫描突变技术，团队进一步精准定位出3个新型线性B细胞表位：2F7识别的¹⁰⁰EYG¹⁰²（罕见的三氨基酸表位）、4D6识别的¹⁰⁰EYGVK¹⁰⁴，以及3E8识别的³⁸⁴FLDIA³⁸⁸。

序列比对分析显示，¹⁰⁰EYG¹⁰²与¹⁰⁰EYGVK¹⁰⁴在BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3所有亚型中高度保守，而³⁸⁴FLDIA³⁸⁸仅在BVDV-1与BVDV-3中保守，这一特性使3E8抗体可特异性区分BVDV-2与其他亚型，为病毒亚型精准诊断提供了可能。

基于上述发现，团队初步建立了两种诊断方法：利用单克隆抗体的Western blotting技术，以及基于表位肽与HRP标记抗体的阻断ELISA技术。实验验证显示，这些方法可准确区分BVDV阳性与阴性血清，具备临床应用潜力。

图 4 NS3单抗对BVDV复制的抑制效果

更值得关注的是，细胞实验表明，3株单克隆抗体均能剂量依赖性抑制BVDV复制，在0.25ng/mL浓度下，病毒复制抑制率即超过50%，RT-qPCR与TCID₅₀检测进一步证实其可显著降低病毒RNA拷贝数与病毒滴度，展现出潜在的抗病毒治疗价值。

研究团队指出，此次发现的罕见三氨基酸表位¹⁰⁰EYG¹⁰²因结构紧凑，或具有更强免疫原性，而表位的保守性特征与抗体的抗病毒活性，为开发广谱BVDV诊断试剂与多表位疫苗提供了关键靶点。不过，目前研究仍局限于线性表位鉴定，尚未涉及构象表位，且诊断方法需大规模临床样本验证，后续将进一步完善这些方向，推动技术落地应用。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.142767