Bcbva 疫苗评估专用 MHA-FBS-NAD 培养基

研究聚焦于蜡样芽孢杆菌炭疽变种（Bacillus cereus biovar anthracis, Bcbva）（携带与炭疽杆菌高度同源的毒力质粒pBCXO1和pBCXO2，分别编码炭疽毒素和聚 γ-D - 谷氨酸（PDGA）荚膜），通过体外（巨噬细胞）和体内（蜡螟幼虫、豚鼠）模型，对比其与炭疽杆菌 Ames 株的孢子形成、毒素分泌、荚膜产量及致病性；结果显示 Bcbva 孢子形成更快更充分、在含人血清和 CO₂条件下产生更多附着型 PDGA 荚膜、被小鼠巨噬细胞内化率更低（1.75% vs 34.80%），且致病性更强（豚鼠鼻内 LD₅₀为3.49×10⁴孢子，是炭疽杆菌 Ames 株的 10.3 倍）；同时验证了兽医常用的Sterne 34F2 疫苗对 Bcbva 的保护效果 —— 免疫豚鼠抗 PA 抗体滴度显著升高，对 100×LD₅₀ Bcbva 的保护率达100%，为非洲热带雨林地区 Bcbva 引发的类炭疽病防控提供关键依据。

一、研究背景与意义：

疾病与病原体基础炭疽病在全球范围内影响家畜和野生动物，偶可传播给人类，主要导致草食动物败血症和猝死，病原体为炭疽杆菌，其孢子可在土壤中持续存在数年形成局部感染区。而 Bcbva 是近年发现的致类炭疽病病原体，革兰氏阳性、产芽孢，被美国 CDC 列为 “选择剂”，在撒哈拉以南非洲热带雨林中致病性强，多种动物（黑猩猩、大猩猩、羚羊、大象等）感染死亡率高，2001 年首次在象牙海岸塔伊国家公园的黑猩猩尸体内发现，后续在喀麦隆、刚果（金）等国也有分布，塔伊国家公园 2001-2015 年近 38% 动物尸骸与 Bcbva 相关。

Bcbva 与炭疽杆菌的关键关联及差异Bcbva 与炭疽杆菌亲缘关系密切，共享孢子产生、环境传播等关键特征，且携带与炭疽杆菌 pXO1/pXO2 高度同源的毒力质粒 pBCXO1（编码致死因子 LF、水肿因子 EF、保护性抗原 PA）和 pBCXO2（编码 PDGA 荚膜）；但 Bcbva 还可产生透明质酸荚膜（炭疽杆菌因 hasA 基因移码突变无法产生），且对 β- 内酰胺类抗生素耐药（炭疽杆菌敏感），两者在致病性机制和防控需求上存在差异。

现有研究缺口此前关于 Bcbva 的研究较少，其孢子形成特性、毒素与荚膜对致病性的调控机制、在巨噬细胞中的存活规律、动物致死剂量（LD₅₀），以及现有炭疽疫苗（如 Sterne 株）对其是否有效的问题均未明确，制约了类炭疽病的防控。

二、主要工作:

研究目标设定对比 Bcbva（象牙海岸分离株 UFBc0009）与炭疽杆菌 Ames 株（UF00738）的孢子形成效率、荚膜产量、毒素分泌量，分析两者在体外巨噬细胞模型中的致病性差异，测定 Bcbva 在体内动物模型中的毒力，并评估 Sterne 疫苗对 Bcbva 感染的保护效果。

实验材料与模型建立

菌株选择：Bcbva UFBc0009（从象牙海岸塔伊国家公园猴尸下颌骨组织分离）、炭疽杆菌 Ames UF00738（1981 年美国德克萨斯州病牛分离，实验室参考株），均在生物安全 3 级（BSL3）条件下操作；

体外模型：小鼠巨噬细胞系 RAW264.7，用于孢子内化实验（MOI=20）和乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测；

体内模型：100-250mg 蜡螟幼虫（评估不同剂量孢子的致死效果）、6-8 周龄 Dunkin-Hartley 豚鼠（通过鼻内感染测定 LD₅₀及疫苗保护率）。

关键检测与实验步骤

孢子形成检测：两种菌株在 HIB 肉汤中培养 1、2、6 天，乙醇处理杀灭营养体后，通过 TSA 平板计数孢子，计算孢子形成效率；

保护性抗原（PA）分泌测定：采用 ELISA 试剂盒检测 HIB、BHI 培养基中 24h 培养上清的 PA 含量；

PDGA 荚膜分析：通过印度墨汁染色观察荚膜形态，ELISA 定量 DMEM+10% 人血清 + 20% CO₂条件下 24h、48h 的附着型 / 分泌型荚膜量、；

巨噬细胞互作实验：检测 Bcbva 与炭疽杆菌 Ames 株孢子被巨噬细胞的内化率，及感染后巨噬细胞的 LDH 释放率（反映细胞毒性）；

动物致病性评估：测定蜡螟幼虫 3 天 LD₅₀、豚鼠鼻内 LD₅₀，通过生存曲线分析毒力差异；

疫苗效果验证：豚鼠皮下接种 1×10⁶个 Sterne 疫苗孢子，4 周后检测抗 PA 抗体滴度和毒素中和活性，再通过鼻内感染 100×LD₅₀孢子评估 14 天存活率。

数据统计分析采用 Shapiro-Wilk 检验验证数据正态性，通过非配对 t 检验、Mann-Whitney U 检验、Kruskal-Wallis 检验、log-rank 检验等分析组间差异，显著水平设为 P<0.05。

参考文献：

Jiranantasak T, Bluhm A P, Chabot D J, et al. Toxin and capsule production by Bacillus cereus biovar anthracis influence pathogenicity in macrophages and animal models[J]. PLoS neglected tropical diseases, 2024, 18(12): e0012779.