突破密度瓶颈：高密度HEK 293培养实现腺病毒产量6倍飞跃

本研究围绕如何在HEK 293细胞的高密度培养中实现腺病毒载体（Ad5）高效表达展开，重点优化了培养基组成与补料策略，通过系统比较不同商业培养基与自制无血清培养基（HEK SFM）在批次和补料分批培养中的表现，显著提升了腺病毒的体积产量。在摇瓶批次培养中，不同培养基对细胞生长和病毒产量的支持能力差异明显，Ex-Cell 293培养基可支持细胞生长至约6×10⁶ cells/mL，而HEK SFM和SFM4Transfx-293则支持至约4×10⁶ cells/mL，Pro293s-CDM表现最差。尽管细胞生长能力存在差异，病毒产量与最大细胞密度之间并无显著相关性，提示单纯提高细胞密度并不能保证病毒产量的提升。

在补料分批培养中，使用SFM4Transfx-293基础培养基配合商业补料CB5可将细胞密度提升至15×10⁶ cells/mL以上，但在感染密度为3–4×10⁶ cells/mL时病毒产量反而下降，表明商业补料虽能促进细胞生长，却未能满足病毒感染阶段的营养需求。为此，研究团队开发了多种自制补料（Feed 1–4），其中Feed 1–4组合使用可在HEK SFM基础培养基中将细胞密度提升至15×10⁶ cells/mL，同时病毒体积产量在感染密度为5×10⁶ cells/mL时达到3.0×10¹⁰ vp/mL，是批次培养条件下产量的6倍，显著突破了“细胞密度效应”的限制。

然而，当该补料分批工艺放大至3L生物反应器时，细胞密度和病毒产量均出现明显下降。生物反应器中细胞最大密度仅为9×10⁶ cells/mL，病毒产量降至1.8×10⁹ vp/mL。进一步分析发现，反应器中葡萄糖消耗速率显著加快，乳酸积累高达38 mM，远高于摇瓶条件下的19.6 mM，提示在高密度培养条件下，营养消耗与代谢副产物积累成为限制病毒表达的主要因素。为验证细胞状态是否为影响病毒产量的关键因素，研究设计实验将不同密度下的细胞离心后重悬于新鲜培养基中，再统一以1×10⁶ cells/mL密度感染病毒。结果显示，细胞特异性病毒产量（CSP）在重悬后基本保持稳定，说明细胞本身状态并非导致病毒产量下降的主因，而更可能是营养限制或代谢抑制所致。

图1 用于评估细胞状态（质量）对Ad5-GFP病毒产量影响的实验设计示意图

为解决反应器放大过程中的产量下降问题，研究进一步优化培养基与补料策略。在HEK SFM基础培养基中添加1 g/L的Sheff-Vax ACF（一种广谱营养补充剂），并在第一次补料中额外添加葡萄糖，确保培养过程中不出现碳源枯竭。优化后的反应器培养在感染密度为4.8×10⁶ cells/mL时，病毒体积产量恢复至31.3×10⁹ vp/mL，细胞特异性病毒产量达6521 vp/cell，与摇瓶条件下感染密度为1×10⁶ cells/mL时的水平相当，表明通过营养优化可有效维持病毒表达效率。

研究最终证实，在高密度感染条件下，维持病毒产量的关键在于营养供给的精准匹配，而非单纯提升细胞密度。商业培养基和补料虽能支持细胞生长，但难以满足病毒复制阶段的复杂营养需求。通过开发定制化培养基和补料策略，尤其是添加富含多种微量元素和生长因子的复合营养源（如ACF），可有效缓解营养限制问题，维持细胞特异性病毒产量，并实现病毒体积产量的显著提升。该研究首次在补料分批生物反应器体系中实现了在感染密度高达5×10⁶ cells/mL条件下仍保持高病毒产量的目标，为腺病毒载体疫苗的规模化、经济化生产提供了可行路径。

综上，本文通过系统优化培养基组成与补料策略，突破了传统批次培养中病毒产量随细胞密度升高而下降的技术瓶颈，实现了在高密度培养条件下病毒表达效率的显著提升。研究强调，病毒生产过程中的营养需求与细胞生长阶段存在显著差异，必须通过精细化的营养调控策略加以匹配。补料分批培养结合定制化培养基与补料，不仅操作简便、成本较低，还能有效提升病毒产量，具备较强的工业放大潜力。该成果为腺病毒载体疫苗及其他病毒类生物制品的高效生产提供了理论依据和技术支持，具有重要的应用价值和推广意义。

来源： 10.3390/vaccines12050524