从实验室到养殖场：“绿色抗菌新星”LysDCp1能否终结抗生素依赖，破解耐药菌困局？

研究背景

产气荚膜梭菌是一种常见的革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，可引发动物肠道疾病，造成动物死亡，带来巨大经济损失。随着抗生素滥用，细菌耐药性问题愈发突出，传统抗生素治疗效果大打折扣。噬菌体及其编码的溶菌酶作为新型抗菌剂，受到广泛关注。溶菌酶具有高效裂解细菌细胞壁、抗菌谱广等优势，且不易引发细菌耐药性。然而，此前对溶菌酶抗产气荚膜梭菌生物膜的研究尚属空白。

研究方法

克隆与表达LysDCp1基因：从噬菌体DCp1基因组中扩增LysDCp1基因，利用CE Design软件设计引物，通过同源重组将PCR产物与pColdTF载体结合，生成重组质粒pColdTF-LysDCp1，将其转化到BL21(DE3)大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素的LB肉汤中培养至特定OD600值后，加入IPTG诱导表达，经超声破碎细胞、离心去除碎片后收集上清液。 

纯化与鉴定LysDCp1蛋白：采用镍柱亲和层析法纯化带有组氨酸标签的LysDCp1蛋白，用不同浓度咪唑洗涤，最后用500 mM咪唑洗脱，透析去除咪唑后，通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定浓度，切下预期大小的条带进行质谱分析。

测定LysDCp1的裂解谱：将53株产气荚膜梭菌菌株及3株其他革兰氏阳性菌分别培养后，与LysDCp1混合在NA琼脂平板上进行点样实验，观察抑菌圈形成情况。 

测定LysDCp1对产气荚膜梭菌的裂解活性：采用浊度降低法测定LysDCp1对产气荚膜梭菌D14的裂解活性，同时设置pCold TF和鸡蛋清溶菌酶分别为阴性、阳性对照，定时测量OD600值，并在8小时后对处理前后的细菌悬浮液拍照，观察浊度变化，还通过显微镜观察细菌形态变化。 

测定LysDCp1的最小抑菌浓度（MIC）：将LysDCp1溶液进行倍比稀释后与产气荚膜梭菌D14悬浮液混合，在96孔板中孵育，测量OD600值，确定MIC值。 

测定LysDCp1的pH和温度耐受性：将产气荚膜梭菌D14分别悬浮于不同pH值的PBS中，加入LysDCp1后孵育，测量OD600值；也将LysDCp1在不同温度下孵育后与细菌混合，测量OD600值。 

测定LysDCp1清除产气荚膜梭菌生物膜的能力：先测定产气荚膜梭菌D14形成生物膜的能力，再用LysDCp1处理已形成的生物膜，通过结晶紫染色法评估生物膜清除效果。

测定LysDCp1的体内抗菌活性：购买健康的大蜡螟幼虫，用产气荚膜梭菌D14感染后，注射不同浓度的LysDCp1，记录死亡率，计算半数致死量（LD50）；还将感染后的幼虫分为不同组，注射不同浓度的LysDCp1，记录3天内的存活率；在感染后24、48、72小时处死幼虫，收集血淋巴，稀释后涂布于TSC琼脂平板上，计数产气荚膜梭菌菌落形成单位，以评估LysDCp1对体内细菌数量的影响。

研究结果

LysDCp1的表达与鉴定：成功克隆并纯化了LysDCp1溶菌酶，其由N端的MurNAc-LAA结构域和C端的SPOR结构域组成（图1A），分子量约77 kDa（图1B），质谱分析显示其氨基酸序列与预测一致。LysDCp1在产气荚膜梭菌菌苔上可形成清晰的噬斑（图1C），且经HRV 3C蛋白酶切割后活性不受影响。 

LysDCp1的裂解谱：LysDCp1对53株产气荚膜梭菌中的41株具有裂解活性，裂解率达82%，但对其他革兰氏阳性菌无裂解活性，表现出明显的物种特异性（表1）。  

LysDCp1对产气荚膜梭菌的裂解能力：经8小时处理，LysDCp1显著降低了产气荚膜梭菌D14悬浮液的OD600值（图2A），处理后的悬浮液明显比未处理的更澄清（图2B），且与同浓度的鸡蛋清溶菌酶杀菌活性相似，显微镜观察显示经LysDCp1处理的细菌结构受损，而经PBS处理的细菌结构完整（图2C-D），显示了LysDCp1对细菌结构的破坏作用。

 LysDCp1的MIC：由图（图3）展示了不同浓度LysDCp1处理后产气荚膜梭菌D14悬浮液的OD600值变化，随着LysDCp1浓度的增加，OD600值逐渐降低，当浓度达到12.5μg/mL及以上时，杀菌效果显著。

 LysDCp1的pH和温度耐受性：LysDCp1在20℃-50℃的温度范围内对产气荚膜梭菌D14表现出最高的裂解活性，在60℃-80℃时活性丧失（图4A）；在pH 7时活性最高，在pH 9时仍具有一定的活性，但在pH 3、5、11时活性丧失（图4B）。

LysDCp1对产气荚膜梭菌D14生物膜的清除能力：成熟的产气荚膜梭菌D14生物膜在36小时内形成（图5A），经LysDCp1处理3小时后，与对照组（PBS）相比，OD570值降低了90%，表明LysDCp1能有效清除生物膜（图5B）。

LysDCp1的体内抗菌活性：产气荚膜梭菌D14对大蜡螟幼虫的LD50为1.4×106 CFU/幼虫。与未用LysDCp1处理的感染幼虫相比，用0.25、0.5和1 μg/μL LysDCp1处理的感染幼虫的72小时存活率分别提高了30%、30%和40%（图6A）。从感染后24小时起，LysDCp1能显著减少幼虫血淋巴中的产气荚膜梭菌数量，且在48小时和72小时时减少效果更为显著（图6B），表明LysDCp1能显著提高感染幼虫的存活率。

结论与展望

LysDCp1溶菌酶对产气荚膜梭菌具有较强的裂解活性和较广的裂解谱，能高效清除细菌生物膜，且在模拟体内实验中表现出良好的抗菌效果，有望成为一种新型的抗菌剂，用于动物产气荚膜梭菌感染的防治，减少抗生素的使用，缓解抗生素耐药性问题。当下，动物养殖业面临的抗生素耐药性危机愈发严峻，传统的抗生素治疗方案逐渐失效，养殖业蒙受巨大损失。LysDCp1溶菌酶的发现犹如一束希望之光，在动物病原菌防治领域开辟了新路径，让我们看到了破解耐药性困局、实现绿色养殖的可能。但要真正将这一成果广泛应用到实际养殖中，还需克服诸多挑战，比如进一步验证其在真实养殖环境下的效果、确保其对动物和环境的安全性等。我们期待未来的深入研究能不断完善这一创新疗法，助力养殖业迈向可持续发展的新阶段。

参考文献链接：

https://doi.org/10.1007/s11259-025-10911-9