免疫信息学驱动的广谱鸭甲肝病毒多表位疫苗设计与跨型免疫实证

背景知识

鸭病毒性肝炎（DVH）由鸭甲肝病毒（DHAV）引起，3 周龄内雏鸭死亡率 >90%。现有单价弱毒苗对 DHAV-1 有效，但对近年上升的 DHAV-3 及混合感染保护不足；病毒结构蛋白（VP0/VP1/VP3）高度变异，急需交叉保护性疫苗。

研究方法

这篇文章主要采用“免疫信息学设计—计算验证—实验验证”三步策略。首先，从 UniProt 数据库下载覆盖 DHAV-1 与 DHAV-3 的代表性结构蛋白（VP0、VP1、VP3）序列，通过 IEDB 服务器中的 BepiPred、Kolaskar & Tongaonkar 及 Parker 亲水性三种算法预测线性 B 细胞表位；利用 NetMHCIIpan-3.1 和 NetMHCcons-1.1 分别预测 15-mer HTL 表位与 9-mer CTL 表位，并以 VaxiJen 评分≥0.4、ToxinPred 无毒、AllergenFP 无过敏原作为过滤条件。随后，用 IEDB 保守性工具在 200 余条 DHAV-1/3 序列中计算表位保守率，锁定 7 条 B 细胞、5 条 HTL、6 条 CTL 高保守表位。将上述表位用柔性 linker（AAY、GPGPG、KK）按 CTL-HTL-B 细胞顺序串联，N 端通过 EAAAK 刚性 linker 连接通用佐剂肽 PADRE，构建 269 aa 的多表位疫苗链。对构建体进行三维建模（Robetta 建模、GalaxyRefine 优化），并以 Ramachandran 图和 ProSA Z-score 评估结构质量；利用 HADDOCK 与鸭 TLR7（PDB：U3I8Q9）进行分子对接，再用 GROMACS 开展 20 ns 分子动力学模拟验证复合物稳定性。基因合成阶段，按大肠杆菌密码子偏好优化序列（CAI=0.85，GC%=50.6%），两端引入 BamHI/EcoRI 位点并克隆至 pET-28a，转化 BL21(DE3) 后用 1 mM IPTG 诱导表达；菌体超声裂解后收集包涵体，经 8 M 尿素溶解、Ni-NTA 亲和层析纯化、梯度透析复性，获得 0.5 mg/mL 的可溶蛋白。免疫实验部分，将疫苗蛋白与弗氏完全/不完全佐剂 1:1 乳化，对 6–8 周龄 BALB/c 小鼠进行 4 次皮下免疫（0、21、35、49 d，50 µg/次），第 10 天采血；间接 ELISA 测抗疫苗抗体滴度，并以实验室制备的 DHAV-1 与 DHAV-3 重组 VP1 蛋白为包被抗原检测交叉滴度；同时用 DHAV-1/3 共感染鸭的阳性血清进行 Western blot，验证疫苗蛋白能否被天然多抗识别。

图 基于免疫信息学的DHAV多表位候选疫苗设计及初步实验验证

研究结果

经多算法筛选，共获得 18 个高抗原、无毒、无过敏原的表位，其中 CTL 表位 SEYAVTAMG 在 DHAV-1 与 DHAV-3 中保守率 >95%，成为跨型保护的核心靶点。设计的多表位链分子量 29.5 kDa，理论 pI 9.92， instability index 35.6（<40），表明为稳定碱性蛋白；二级结构含 42.4% α-螺旋、23.1% β-折叠，三维模型 91.6% 残基位于 Ramachandran 允许区，ProSA Z-score −5.18，结构质量优良。分子对接显示疫苗与鸭 TLR7 结合能为 −111.0±21.2，静电作用贡献 −265.4 kcal/mol；20 ns 动力学轨迹中，复合物 RMSD 在 10 ns 后稳定于 2.5 nm，结合界面 RMSF<1.5 nm，平均氢键 7 条，提示结合稳定且构象变化小。原核表达在 30 kDa 处出现清晰条带，纯化后纯度≥90%，Western blot 抗 His 标签呈单一条带。小鼠免疫后血清抗疫苗终点滴度达 1:128 000；以 DHAV-1 VP1 包被时滴度为 1:32 000，以 DHAV-3 VP1 包被时为 1:16 000，交叉反应指数显著。鸭多抗血清 Western blot 在 30 kDa 处出现特异性识别条带，证实疫苗蛋白保留了天然感染中可暴露的免疫优势表位。上述结果构成“计算设计—受体结合—动物免疫—交叉血清”四级证据链，首次证明该多表位亚单位疫苗具备诱生高滴度、跨 DHAV-1/3 型交叉抗体的能力。

结论与意义

这项研究首次把“表位保守性-受体结合-动物免疫”全链条验证用于 DHAV，证明免疫信息学设计的多表位亚单位疫苗能同时诱生高滴度、跨型交叉抗体，为后续鸭只攻毒试验和商品化广谱疫苗奠定配方与评价框架，也为其他多型禽病毒疫苗提供可复制的方法学模板。

参考来源：Yang, Y.; Chen, X.; Liu, A.; He, J.; Cao, Y.; He, P. A Highly Immunogenic and Cross-Reactive Multi-Epitope Vaccine Candidate Against Duck Hepatitis A Virus: Immunoinformatics Design and Preliminary Experimental Validation. Int. J. Mol. Sci. 2025, 26, 10958. https://doi.org/10.3390/ijms262210958