告别胎牛血清：科学家为"毛孩子"干细胞治疗打造纯净培养配方

本研究由美国食品药品监督管理局（FDA）兽医应用研究中心的研究团队完成，聚焦于犬脂肪来源间充质干细胞在无血清培养基中的分离与扩增技术。研究团队成功开发了一种化学成分明确的培养基配方，能够有效替代传统的胎牛血清培养体系，为兽医临床细胞治疗产品的标准化生产提供了重要技术支持。

该研究的核心成果在于建立了一套完整的无血清培养体系。研究团队首先采用Sato的经典方法配制基础无血清培养基，以DMEM与Ham's F-12营养混合物作为基础，按等比例混合以平衡营养成分的浓度与种类。在此基础配方中，研究者系统性地添加了多种关键组分：脂质浓缩物提供细胞膜合成所需的脂肪酸；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺替代不稳定的谷氨酰胺；牛血清白蛋白作为载体蛋白；胎球蛋白促进细胞贴壁；胰岛素、氢化可的松和孕酮等激素调节细胞代谢；全铁转铁蛋白负责铁离子转运；腐胺等多胺类物质维持细胞自我更新能力；L-抗坏血酸-2-磷酸作为抗氧化剂保护细胞；同时添加HEPES和碳酸氢钠双重缓冲系统维持培养环境稳定。这一基础配方被证实能够支持犬脂肪干细胞的扩增，但克隆形成能力仍有提升空间。

图1 评估基础无血清培养基对犬脂肪来源间充质干细胞扩增影响的示意图。

在生长因子优化方面，研究团队通过系统的组合筛选，最终确定碱性成纤维细胞生长因子与血小板衍生生长因子的协同作用最为关键。单独添加碱性成纤维细胞生长因子可促进细胞增殖并形成更致密的克隆团块，而联合添加血小板衍生生长因子后，克隆形成效率和密度进一步提升。相比之下，转化生长因子-β1对犬脂肪干细胞呈现抑制作用，这与该因子在人源干细胞中的促增殖作用截然不同，也解释了为何商业化的无血清培养基无法支持犬细胞生长。表皮生长因子虽有一定作用，但效果不及前两种因子的组合。最终确定的最优配方为基础无血清培养基添加每毫升2纳克碱性成纤维细胞生长因子和每毫升2纳克血小板衍生生长因子。

在细胞分离效率方面，无血清培养基展现出显著优势。研究采用直接从脂肪组织分离原代细胞的策略，对比了含血清培养基与优化后的无血清培养基。结果显示，无血清体系中的细胞在培养第12天即达到近汇合状态，而含血清培养基中的细胞仅覆盖30%至40%的培养表面。定量分析表明，无血清组的细胞产量显著高于血清组，群体倍增时间更短，滞后期减少。更重要的是，无血清体系表现出更稳定的生长表现，不同供体动物来源的细胞均能获得良好扩增，而血清组的生长率波动较大，部分供体细胞甚至出现难以贴壁或克隆形成失败的情况。这种一致性对于临床级细胞产品的标准化生产至关重要。

细胞表型分析证实，无血清培养体系不会影响干细胞的身份特征。流式细胞术检测显示，无论培养条件如何，绝大多数细胞均维持CD44和CD90双阳性表达，这是犬脂肪干细胞的经典标志物组合。细胞形态学观察也显示典型的成纤维样梭形外观，无血清组的细胞体积略小于血清组，可能反映了更活跃的增殖状态。这些结果表明，化学成分明确的培养环境能够完整保留干细胞的免疫表型特征。

多向分化潜能评估进一步验证了干细胞的功能完整性。成骨诱导实验中，无血清组细胞在特定诱导条件下形成了密集的矿化结节，茜素红染色和冯库萨染色均显示强烈的钙沉积信号，与血清组细胞的表现相当。软骨分化方面，甲苯胺蓝染色显示无血清组细胞产生了富含硫酸化蛋白聚糖的细胞外基质，软骨球形态良好。脂肪分化实验中，油红染色清晰显示细胞内脂滴积累，细胞呈现典型的立方形脂肪细胞形态。这些结果共同证明，无血清培养基中扩增的犬脂肪干细胞完整保留了三系分化潜能，其功能性未受培养条件转换的影响。

该研究还深入探讨了培养基成分选择的科学依据。虽然最终配方仍含有牛源白蛋白、胎球蛋白和胰岛素等动物成分，但研究者明确指出这些组分均经过严格表征，批次间一致性高，且可被替代。例如，牛血清白蛋白的Cohn V组分具有良好的脂肪酸结合能力，若需完全避免异种蛋白，可采用犬源白蛋白替代，尽管成本较高且工艺复杂。胎球蛋白作为主要的细胞贴壁因子，其作用机制已被阐明，而凝胶或纤连蛋白等替代物无法直接添加至液体培养基中。这些考量体现了从研究级向临床级培养体系过渡时的实际挑战。

研究的最终结论强调，物种特异性是无血清培养基开发的关键原则。人源干细胞培养基中的优化配方，如含转化生长因子-β1的商业产品，并不适用于犬细胞，反而可能产生抑制作用。这一发现提示，跨物种应用培养基时必须进行严格的验证实验，不能简单类推。该研究所建立的无血清体系为犬类再生医学的临床转化奠定了基础，未来研究需进一步评估这些细胞在体内的功能活性与治疗效果，并探索该配方对其他组织来源犬干细胞及不同物种干细胞的适用性。

国内生物科技企业广东环凯生物科技有限公司也已开发出适用于兽用疫苗生产的无血清培养基系列产品，为兽用生物制品的无血清工艺国产化提供了重要支撑。

来源：10.1371/journal.pone.0210250