本研究成功开发了一种名为Tri-basal 2.0+的简单且稳健的无血清培养基，该培养基由三种核心成分——成纤维细胞生长因子2（FGF2，2 ng/mL）、胎球蛋白（fetuin，600 μg/mL）、牛血清白蛋白（BSA，75 μg/mL）以及胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS，1x）补充剂组成，以DMEM/F12作为基础培养基。这一配方在支持牛卫星细胞、猪卫星细胞以及小鼠C2C12肌肉细胞增殖方面表现出色，甚至在增殖性能上超越了传统的10%胎牛血清（FBS）培养条件。

通过系统的优化过程，研究团队确定了各组分的最佳浓度。其中，胎球蛋白被证明是最关键的增殖促进因子，其单独使用即可显著提升细胞增殖，而FGF2的最佳浓度被确定为2 ng/mL，这一剂量远低于以往研究中常用的10-100 ng/mL范围，大幅降低了培养基成本。值得注意的是，当使用DMEM/F12替代DMEM作为基础培养基时，细胞增殖获得了超过4倍的提升，这一发现凸显了基础培养基组成对无血清培养性能的重要影响。

图1 无血清培养基开发的实验设置

在短期增殖实验中，Tri-basal 2.0+展现出优异的细胞支持能力。与含血清培养基相比，该无血清配方不仅维持了更高的细胞增殖速率，还在细胞附着方面表现出显著优势。特别是在使用Matrigel包被的培养表面时，Tri-basal 2.0+能够有效促进细胞贴壁，尽管其效果略低于10% FBS，但远优于基础培养基。这种附着能力的提升主要归因于胎球蛋白的存在，该蛋白不仅能够直接促进细胞贴壁，还可能通过调节钙信号传导和细胞外囊泡的分泌来增强细胞间的相互作用。

长期培养实验进一步验证了该培养基的稳健性。在为期5天的活细胞监测中，Tri-basal 2.0+组的细胞持续增殖，并在第72小时后显示出优于10% FBS的生长曲线，最终达到更高的细胞密度。这种优势在多代传代实验中得到了进一步确认——细胞可在该培养基中连续培养19天并传代3次，无需使用血清进行种子培养或胰蛋白酶失活，且无需离心步骤，仅通过直接转移即可实现1:6的传代比例。相比之下，10% FBS组在传代后的生长表现明显逊色。

该培养基对多种物种来源的肌肉细胞均表现出良好的适用性。在猪卫星细胞培养中，Tri-basal 2.0+在3天和5天的培养后均显示出优于10% FBS的增殖效果。对于小鼠C2C12细胞系，虽然在第3天时其表现与5% FBS相当，但在第5天时其增殖能力显著提升，接近甚至达到10% FBS的水平。此外，该培养基在人类肝癌细胞系HepG2中也表现出与10% FBS相似的支持效果，表明其具有广泛的细胞类型适应性。

转录组学分析揭示了Tri-basal 2.0+促进细胞增殖的分子机制。与基础培养基相比，该配方显著上调了538个基因的表达，其中包括关键的增殖标志物基因如MKI67（增殖标志物Ki-67，上调9.58倍）、CCNA2（细胞周期蛋白A2，上调8.42倍）、CDC20（细胞分裂周期蛋白20，上调7.98倍）和CCNB1（细胞周期蛋白B1，上调6.92倍）。通路富集分析显示，细胞周期、有丝分裂细胞周期、纺锤体形成和细胞器分裂等通路被显著激活。与此同时，与肌节、肌原纤维和收缩纤维相关的基因则呈现下调趋势，表明细胞处于增殖状态而非分化状态。

有趣的是，当比较Tri-basal 2.0+与10% FBS时，仅发现26个差异表达基因，且全部在Tri-basal 2.0+组中上调。这些基因主要参与脂质、胆固醇、次级醇和类固醇的生物合成过程，提示该无血清培养基可能通过优化脂质代谢途径来支持细胞生长。这一发现对于理解无血清条件下细胞代谢重编程具有重要意义。

研究还发现，向Tri-basal 2.0+中添加肝细胞生长因子（HGF）可显著增强长期增殖性能。在转录组水平上，HGF的添加导致ETV1（ETS变异体1，上调10.86倍）和DUSP6（双特异性磷酸酶6，上调7.95倍）等基因的表达显著增加，这些基因与细胞存活、抗凋亡和干细胞特性维持相关。同时，HGF处理组中GREB1（雌激素调节的生长因子1，下调6.03倍）的表达降低，该基因的下调有助于延缓细胞衰老。此外，HGF还显著上调了MT2A（金属硫蛋白2A）、CDCA2（细胞分裂周期相关蛋白2）、BRCA2（乳腺癌易感基因2）等涉及DNA修复、染色体稳定性和抗复制应激的基因表达，同时降低了促凋亡基因GADD45G的表达水平。

在功能性验证方面，经过多代培养后的细胞仍保留了肌源性分化能力。在特定条件下，这些细胞能够成功融合形成肌管，并表达肌球蛋白重链，证明长期在无血清条件下培养并未损害细胞的终末分化潜能。这一特性对于培养肉生产尤为关键，因为它意味着该培养基不仅能够支持细胞的大量扩增，还能保持细胞形成肌肉组织的最终功能。

成本分析显示，由于FGF2的使用浓度可降低至2 ng/mL，即使采用实验室规模生产的重组蛋白，该生长因子的成本也可控制在每升培养基0.015美元左右。然而，胎球蛋白目前仍是主要的成本驱动因素，商业来源的胎球蛋白价格约为每升培养基80美元。因此，未来的研究需要关注胎球蛋白的重组生产或寻找功能替代物，如植物蛋白水解物，以进一步降低培养基成本。

综上所述，Tri-basal 2.0+代表了一种简单、高效且化学成分明确的无血清培养基方案，其通过精确平衡FGF2、胎球蛋白和BSA的浓度，结合ITS补充剂，实现了对肌肉干细胞的高效扩增。该培养基不仅消除了对动物血清的依赖，还在增殖性能上超越了传统含血清培养基，为细胞培养肉的大规模生产提供了可行的技术路径。其分子机制的阐明也为进一步优化细胞培养条件和开发更经济高效的培养基配方提供了理论基础。

来源：10.1016/j.foodres.2023.113194