这项研究评估了化学定义的无血清培养基N2B27作为猪胚胎体外培养替代方案的可行性，并深入探究了成纤维细胞生长因子2（FGF2）和骨形态发生蛋白4（BMP4）对猪孤雌激活胚胎谱系定向分化的调控作用。

研究首先比较了三种培养条件下的胚胎发育结局：传统猪受精卵培养基3（PZM3）、添加10%胎牛血清的PZM3（PZM+FBS）以及N2B27无血清培养基。实验结果显示，N2B27在多项发育指标上显著优于两种PZM3培养体系。具体而言，N2B27组的囊胚形成率达到48%，显著高于PZM组的28.7%和PZM+FBS组的32%；孵化囊胚率更是达到25.8%，远超PZM组的0.7%和PZM+FBS组的5.9%。细胞计数分析表明，N2B27组囊胚的总细胞数显著增加，上胚层（SOX2阳性）、原始内胚层（SOX17阳性）和滋养外胚层（CDX2阳性）的细胞数量均显著高于两个对照组。

谱系分配比例分析揭示了N2B27独特的调控效应。与PZM组相比，N2B27显著提高了上胚层分配比例（提高22.1%），同时大幅增加了原始内胚层分配比例（提高约509.2%）。然而，与PZM+FBS组相比，N2B27的上胚层分配比例降低了34.9%，而原始内胚层分配比例则提高了37.2%。滋养外胚层分配比例在三组间无显著差异。这表明N2B27在支持整体胚胎发育的同时，倾向于促进原始内胚层的分化，而上胚层比例介于无血清和血清培养之间。

鉴于猪胚胎在植入前阶段具有快速扩展胚外谱系的特性，研究进一步考察了FGF2和BMP4这两种调控胚外谱系分化的关键信号分子。单独添加FGF2（40 ng/mL）或BMP4（25 ng/mL）并不影响囊胚形成率、孵化囊胚率和总细胞数，但显著改变了谱系分配格局。FGF2处理使上胚层细胞数量显著减少，原始内胚层细胞数量显著增加；BMP4处理同样增加了原始内胚层细胞数量。谱系比例分析显示，FGF2使上胚层分配比例降低62.8%，BMP4使原始内胚层分配比例提高67.3%，滋养外胚层比例在各处理间保持稳定。

图1 实验设计。孤雌激活受精卵在PZM3培养基中培养至桑椹胚阶段（96小时），随后转移至不同培养条件下继续培养至晚期囊胚阶段（168小时）

第一组实验评估PZM、PZM+胎牛血清（FBS）以及N2B27三种培养基的培养效果；第二组实验分析分别添加成纤维细胞生长因子2（FGF2）或骨形态发生蛋白4（BMP4）的N2B27培养基的作用；最后一组实验探究同时添加FGF2与BMP4的N2B27培养基的处理效果。

联合使用FGF2和BMP4产生了协同效应。与单独处理类似，联合处理不影响囊胚发育率和总细胞数，但对谱系分配产生了更为显著的调控作用。上胚层细胞数量和分配比例均显著降低，原始内胚层细胞数量和分配比例则显著增加。定量分析显示，联合处理组的上胚层分配比例较N2B27对照组降低74.6%，原始内胚层分配比例提高112.7%，而滋养外胚层比例仍维持不变。

免疫荧光染色直观展示了各处理组的谱系标记表达特征。SOX2阳性细胞（上胚层）在N2B27组呈散在分布，在FGF2和联合处理组明显减少；SOX17阳性细胞（原始内胚层）在BMP4和联合处理组聚集成簇，数量显著增多；CDX2阳性细胞（滋养外胚层）在各组均广泛分布于囊胚外围，数量相对稳定。

机制探讨方面，研究指出N2B27的优越性能可能与其独特成分组成相关。N2B27含有L-肉碱，可促进脂肪酸进入线粒体进行β-氧化，满足猪胚胎高脂质代谢需求；B27补充剂中的无脂肪酸牛血清白蛋白可作为疏水成分载体，并提供定义明确的多元不饱和脂肪酸；丰富的抗氧化成分（维生素E、还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶）可缓解猪胚胎敏感的氧化应激损伤。此外，B27中的维生素A/视黄酸可能通过激活视黄酸受体信号促进原始内胚层分化，这解释了N2B27组原始内胚层比例显著升高的现象。

对于FGF2和BMP4的作用机制，研究认为FGF2通过激活ERK/MAPK信号通路驱动原始内胚层分化，这与小鼠和其他哺乳动物中的发现一致；BMP4则通过SMAD1/5/8信号通路支持原始内胚层和滋养外胚层的形成。两种信号通路的协同激活可能通过汇聚调控下游靶基因，共同促进原始内胚层命运决定，同时抑制上胚层自我更新程序。

该研究还讨论了实验局限性。所有胚胎均采用孤雌激活方式获得，缺乏父源基因组贡献，可能存在基因组印记异常和X染色体基因表达失调，因此结论的普适性需在体外受精胚胎中进一步验证。此外，谱系分析仅依赖免疫荧光细胞计数，未结合谱系特异性分子谱分析，无法确定培养条件是否改变各谱系内部的转录程序。

总体而言，这项研究证实N2B27可作为猪胚胎体外培养的有效无血清替代方案，在消除血清批次差异的同时显著提升发育效率。更重要的是，研究揭示了FGF2和BMP4联合调控可定向诱导原始内胚层分化，为优化猪胚胎植入前发育、提高干细胞衍生效率以及深入理解猪早期胚胎谱系决定机制提供了重要实验依据和技术手段。

来源：10.1016/j.theriogenology.2026.117854