基于反向疫苗学的羊种布鲁氏菌多表位疫苗设计：从表位筛选到TLR4互作验证与动物免疫评价

背景知识

布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患胞内感染性疾病，主要由羊种布鲁氏菌引起，临床表现为发热、关节炎、乏力及多系统慢性感染，在我国北方及牧区发病率居高不下。由于布鲁氏菌为兼性胞内寄生菌，常规抗生素治疗难以彻底清除，且现有疫苗多为减毒活疫苗，存在毒力返强、干扰血清学诊断等安全隐患，因此亟需开发新型安全高效的亚单位疫苗。反向疫苗学通过生物信息手段从病原体全蛋白组中预测免疫优势表位，绕过传统培养与灭活步骤，可精准设计多表位疫苗。Omp10、Omp25、Omp31等外膜蛋白在既往研究中已被证实具有良好的免疫原性，其中Omp25还可通过激活MAPK信号通路参与炎症调控；而BtpB作为TIR结构域效应蛋白，能够抑制宿主TLR信号及树突状细胞活化。基于上述蛋白的表位信息构建MEV，有望同时激活CTL、HTL及B细胞介导的多层次免疫保护。

研究方法

研究首先利用ProtParam、VaxiJen等工具对13种布鲁氏菌候选蛋白进行抗原性、不稳定性指数、等电点及亲水性（GRAVY）比较，最终选定Omp10、Omp25、Omp31和BtpB作为靶标。通过SignalP-5.0和LipoP-1.0预测并去除信号肽后，采用IEDB、NetCTLpan1.1、NetMHCIIpan4.0、ABCpred、BCPREDS及Ellipro等服务器分别预测CTL、HTL、线性B细胞及构象B细胞表位；经VaxiJen抗原性、AllergenFP过敏原性及ToxinPred毒性筛选后，保留非过敏且无毒性的优势表位。随后使用AAY连接CTL表位、GPGPG连接HTL表位、KK连接B细胞表位，并在N端通过EAAAK刚性连接肽引入hBD3与PADRE佐剂序列，C端添加6×His标签，构建完整MEV序列。利用SOPMA预测二级结构，RoseTTAFold预测三级结构，并通过ProSA-web（Z-score）及SWISS-MODEL Ramachandran图评估模型质量。进一步采用HDOCK服务器进行MEV与TLR4受体（PDB: 4G8A）的分子对接，利用GROMACS 2021.3进行10 ns分子动力学模拟，分析RMSD、RMSF、RoG及非键相互作用能。通过C-ImmSim服务器进行免疫模拟，预测疫苗在体内的免疫应答动态。最后使用JCat进行大肠杆菌密码子优化（CAI = 0.96），并在SnapGene中完成虚拟克隆与模拟PCR。动物实验部分，将20只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为PBS对照组与MEV组，经鼻内途径免疫15天，通过ELISA检测血清IgG1、IgG2a及肺泡灌洗液sIgA水平，并以ELISPOT检测肺与脾淋巴细胞在热灭活RB51刺激下分泌IFN-γ的能力。

研究结果

生物信息学筛选共获得13个CTL优势表位、17个HTL优势表位、9个线性B细胞表位及2个构象B细胞表位。所构建的MEV含806个氨基酸，分子量86,249.70 Da，理论等电点显示其为稳定蛋白（不稳定性指数20.79），GRAVY值为−0.459，属于亲水性蛋白；VaxiJen抗原性评分0.9750，SOLpro可溶性预测0.99，且AllergenFP分析无过敏原性。二级结构预测显示α-螺旋占20.84%、β-转角8.44%、无规卷曲44.17%、延伸链26.55%；三级结构经ProSA-web验证Z-score为−7.32，Ramachandran图显示90.80%残基位于有利区，模型质量可靠。分子对接结果表明MEV与TLR4结合紧密（对接得分−328.00），分子动力学模拟显示10 ns内RMSD总体波动不超过0.65 nm，RMSF在100–650位残基区域波动温和，回转半径（RoG）波动小于0.05 nm，非键相互作用总能量为-734.058 kJ/mol，证实复合物结构稳定。免疫模拟显示三次免疫后B细胞与Th细胞数量显著升高并达峰值，IgM与IgG持续增高，同时IFN-γ、TGF-β、IL-10及IL-18等细胞因子水平明显上升。动物实验表明，与PBS对照组相比，MEV组血清IgG1与IgG2a水平显著升高（P < 0.01），且IgG2a/IgG1比值显著高于对照组，提示Th1型免疫应答优势；肺泡灌洗液中sIgA水平亦显著升高（P < 0.01）。ELISPOT结果显示，在HKRB51抗原刺激下，MEV组肺与脾淋巴细胞产生的IFN-γ斑点形成细胞（SFC）数量均显著高于对照组（P < 0.01），而无关多肽SAG4对照组无显著差异，表明MEV能够同时诱导体液免疫与细胞免疫。

图 动物实验免疫效果评价

结论与意义

本研究通过整合反向疫苗学、免疫信息学、结构生物学及实验免疫学手段，成功设计并验证了一种针对羊种布鲁氏菌的新型多表位候选疫苗。该疫苗兼具高免疫原性、良好的理化稳定性、亲水可溶性及无过敏原性等优势，能够通过激活TLR4信号有效诱导偏向Th1的特异性体液与细胞免疫应答。研究不仅为布鲁氏菌病提供了一条安全、精准的亚单位疫苗开发路径，也为后续基于表位疫苗的优化表达、制剂工艺及保护效力评价奠定了理论基础。此外，研究所采用的“生物信息学预测—分子互作验证—动物免疫评价”策略可推广至其他胞内寄生菌疫苗的设计，具有重要的方法学借鉴意义。

参考来源：Li, M., Zhu, Y., Niu, C. et al. Design of a multi-epitope vaccine candidate against Brucella melitensis. Sci Rep 12, 10146 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14427-z.