重组HVT二价载体疫苗共表达IBDV VP2与H9N2 HA诱导鸡体高效体液与细胞免疫保护

背景知识

传染性法氏囊病病毒（IBDV）与H9N2亚型禽流感病毒（AIV）是当前全球养禽业面临的两大核心病原。IBDV作为双链RNA病毒，其基因组分节段特性驱动了持续的基因重配与抗原变异，导致现有疫苗免疫逃逸频发；该病毒主要侵害法氏囊等中枢免疫器官，引发严重免疫抑制，进而削弱宿主对其他疫苗或病原的防御能力。H9N2 AIV则因广泛流行、持续排毒及造成产蛋下降等重大经济损失而备受关注。目前防控主要依赖传统灭活疫苗或弱毒活疫苗，但前者需多次加强免疫且主要诱导体液抗体，难以激发有效的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答，也无法完全阻断病毒脱落；后者存在毒力返强风险。火鸡疱疹病毒（HVT）作为马立克氏病病毒（MDV）的非致瘤血清型，已被证实可在宿主体内建立持续性感染，通过细胞结合传播方式持续表达外源抗原，并能借助MHC-I类分子途径有效递呈抗原以激活CD8+ T细胞，因此被视为理想的活病毒载体疫苗平台。然而，单一HVT载体能否在同一基因组中稳定共表达IBDV VP2与H9N2 HA两种外源抗原，并同时诱导针对两种病原的均衡且高效的体液与细胞免疫应答，此前尚缺乏系统验证，这正是本研究拟解决的关键科学问题。

研究方法

研究首先采用基于大肠杆菌Red重组酶的两步同源重组策略，在HVT BAC骨架上依次插入外源基因表达盒：第一步将CMV启动子驱动的VP2基因表达盒（含KanR筛选标记）定向整合至HVT UL55基因座，随后通过I-SceI内切酶介导的二次重组剔除筛选标记，获得rHVT BAC-VP2中间质粒；第二步以相同策略将HA基因表达盒插入RR基因座，最终构建无标记的rHVT BAC-VP2-HA重组质粒。经PCR扩增、DNA测序验证插入正确后，利用脂质体转染法将重组BAC质粒转染原代鸡胚成纤维细胞（CEFs）进行病毒拯救，并通过间接免疫荧光试验（IFA）分别使用HVT多抗、IBDV VP2单抗及H9N2多抗确认三种抗原的表达。体外生物学特性分析包括：与亲本HVT BAC进行噬斑形态比较、多步生长曲线测定（qPCR定量SORF1/OVO拷贝数比），以及连续传代20代后通过IFA检测VP2和HA的表达稳定性。动物实验选用1日龄SPF鸡随机分为rHVT BAC-VP2-HA免疫组、商品化灭活疫苗组及DMEM mock组，每组45羽，经颈部皮下接种。免疫后连续5周监测体重变化，并定期采血通过血凝抑制（HI）试验检测HA特异性抗体、通过间接ELISA检测VP2特异性抗体；免疫后28天处死部分鸡只，分离脾脏淋巴细胞，利用流式细胞术（CD3/CD4/CD8a/Bu-1标记）分析T、B淋巴细胞亚群比例。攻毒保护试验在免疫后28天进行，各组15羽分别经眼鼻途径攻击强毒IBDV（104 EID50/100 μL）或H9N2 AIV（104 EID₅₀/100 μL），另设15羽不攻毒对照；攻毒后连续7天观察临床症状与死亡率，采集法氏囊和气管组织进行HE染色病理学检查、qPCR检测病毒载量，并收集咽肛拭子通过鸡胚接种与血凝试验评估排毒情况。

研究结果

重组病毒rHVT BAC-VP2-HA的构建与拯救获得成功：PCR与测序证实VP2与HA基因分别正确插入UL55和RR位点，IFA在感染CEFs中检测到清晰的HVT、VP2及HA特异性荧光信号。体外特性分析显示，重组病毒与亲本HVT BAC的噬斑面积无显著差异（P > 0.05），1–5天的多步生长曲线中病毒基因组拷贝数亦无显著差异，表明外源基因插入未影响病毒复制能力；连续传代至第20代后，VP2和HA蛋白表达依然稳定，证明重组病毒具有优良的遗传稳定性。动物安全性评价显示，免疫组鸡只体重增长与mock组及灭活疫苗组无显著差异，证实该重组疫苗具有良好的体内安全性。体液免疫方面，rHVT BAC-VP2-HA组与灭活疫苗组的HA特异性HI抗体滴度及VP2特异性IgG抗体水平均随免疫时间延长而稳步升高，并于免疫后28天达到峰值平台期，两组之间无显著差异，但均显著高于mock组。细胞免疫分析则揭示了两者的显著差异：rHVT BAC-VP2-HA免疫组脾脏中CD3⁺CD8⁺ T细胞比例显著高于mock组及灭活疫苗组（P < 0.001），而CD3+CD4+ T细胞和B细胞（Bu-1+）比例则显著低于灭活疫苗组（P < 0.05），提示HVT载体更倾向于诱导CTL主导的免疫应答。攻毒保护试验中，针对强毒IBDV，mock组出现典型临床症状、死亡及严重法氏囊病理损伤（皮质髓质界限消失、淋巴细胞坏死），而两个疫苗组均无临床症状与死亡，法氏囊病毒载量显著降低（P < 0.0001），BBIX指数接近健康对照；针对H9N2 AIV，mock组出现抑郁、腹泻等症状且所有鸡只均排毒，灭活疫苗组保护率为93.3%（1/15排毒），而rHVT BAC-VP2-HA组所有鸡只均无临床症状、气管无病理损伤、病毒载量显著降低，且咽肛拭子检测完全阴性，实现100%保护并彻底阻断病毒脱落。

图 重组病毒rHVT BAC-VP2-HA的构建与鉴定

结论与意义

本研究成功构建并系统评价了共表达IBDV VP2与H9N2 HA的重组HVT二价疫苗候选株rHVT BAC-VP2-HA。该重组病毒不仅保持了与亲本病毒相似的体外复制特性和高度的遗传稳定性，而且在SPF鸡中表现出良好的安全性与广谱免疫原性。其最大优势在于突破了传统灭活疫苗仅能强诱导体液免疫的局限，通过HVT载体的细胞内持续抗原表达机制，有效激活了CD8+细胞毒性T淋巴细胞应答，从而在H9N2攻毒中实现了完全阻断排毒的卓越保护效果，在IBDV攻毒中也提供了与商品化疫苗相当的高效保护。该成果为禽类重大病毒性疾病的联合防控提供了新的技术路径，凸显了HVT载体疫苗在开发多价、长效、能够同时激发体液与细胞免疫的下一代禽用疫苗中的巨大应用潜力，对降低养禽业因IBDV免疫抑制与H9N2持续流行造成的复合损失具有重要的实践指导价值。

参考来源：Zhang, Y., Yang, X., Kang, Y., Zhu, W., Sun, Y., Qi, S., Chen, Y., Zhuang, G., Sun, A.-J. Co-expression of IBDV VP2 and H9N2 HA by recombinant HVT induces high protection against both pathogens in chickens. bioRxiv 2026.05.12.724538. https://doi.org/10.64898/2026.05.12.724538