打破血清依赖：猪多能干细胞的“纯净”培养革命

原创

来源：李湘

2026-05-14 17:13:58

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核心提示：本研究成功建立了一种化学成分明确的KOFL无血清培养体系，实现了猪多能干细胞在无饲养层条件下的长期稳定培养与多能性维持，并证实其具有三胚层分化潜能及参与胚胎发育的能力。

这篇文献成功建立了一种化学成分明确的无血清、无饲养层的猪多能干细胞（pPSCs）培养体系（KOFL），并对其进行了全面鉴定。

在培养体系优化方面，研究发现N2B27添加剂对于维持pPSCs的克隆形态和增殖能力至关重要，而 knockout 血清替代物（KOSR）并非必需成分。在三种基础培养基中，KO-DMEM和DMEM/F12均支持pPSCs的增殖和多能性维持，但KO-DMEM在囊胚贴附率（82.91% vs 53.72%）、原代集落形成率（11.63% vs 2.31%）以及稳定传代细胞系建立率（13.22% vs 0%）方面均显著优于DMEM/F12，且只有KO-DMEM组能够获得可稳定传代的细胞系。Neurobasal则无法支持pPSCs增殖。基于此，研究确定了以KO-DMEM为基础、添加N2B27、bFGF和hLIF的优化培养体系，命名为KOFL。

通过该体系建立的pPSC-KOFLs细胞系已稳定传代超过45代。这些细胞呈现扁平集落形态，细胞间连接紧密，核质比高，类似人胚胎干细胞形态特征。细胞表现出强碱性磷酸酶活性，具有正常的猪二倍体核型（38对染色体），群体倍增时间为38.4小时，增殖速度优于传统培养体系中的pPSCs。免疫荧光和相对定量RT-PCR检测证实，不同代次的pPSC-KOFLs均稳定表达核心多能性标志物OCT4、SOX2和NANOG，Western blot结果也验证了这些标志物在蛋白质水平的表达。

图1 无血清培养体系的优化

多能性功能性验证显示，pPSC-KOFLs在体外能够形成拟胚体，拟胚体中多能性基因表达下调而三胚层标志物表达上调。自发分化后可获得表达GATA6（内胚层）、波形蛋白（中胚层）和GFAP（外胚层）的细胞。在神经诱导条件下，拟胚体可分化为表达β-微管蛋白的神经元样细胞和表达GFAP的星形胶质细胞。体内分化实验表明，将pPSC-KOFLs皮下注射到裸鼠体内可形成畸胎瘤，组织学检查显示瘤体包含消化管（内胚层）、肌肉（中胚层）和皮肤（外胚层）等典型三胚层组织。

为验证发育潜能，研究通过慢病毒载体将增强型绿色荧光蛋白（eGFP）导入pPSC-KOFLs，获得稳定表达eGFP的pPSC-KOFL-FEs细胞。这些标记细胞保持正常核型和未受损的多能性。以这些细胞作为供体进行体细胞核移植，其融合率（59.9%）和卵裂率（68.7%）与猪胚胎成纤维细胞对照组无显著差异。将pPSC-KOFL-FEs注射到第4.5天体外受精猪囊胚腔中，成功获得嵌合囊胚，荧光显微镜观察证实供体细胞能够整合到内细胞团和滋养外胚层中，表明其具有参与胚胎发育的潜能。

信号通路分析揭示，与MXV体系培养的pPSCs相比，pPSC-KOFLs中JAK/STAT通路的关键效应分子GP130和JAK表达上调，FGF/MEK通路的bFGF、FGFR1和FGFR2表达也显著上调。Wnt信号通路中LRP6、GSK3β、β-CATENIN和TCF3表达上调而APC表达下调，提示该通路可能被激活。相比之下，BMP和PI3K信号通路的关键效应分子未出现显著上调，表明pPSC-KOFLs可能依赖JAK/STAT和FGF/MEK信号通路维持未分化状态，而对BMP和PI3K信号通路的依赖性较低。

在无饲养层培养方面，研究系统比较了F-肌动蛋白、胎牛血清、0.1%明胶以及不同稀释比例Matrigel作为培养基质的效果。结果发现pPSC-KOFLs仅能在较低浓度的Matrigel（1:2、1:3和1:4稀释）上存活和增殖，其中1:2稀释比例的Matrigel效果最佳。在该条件下，细胞可连续传代并保持碱性磷酸酶阳性和正常核型。免疫荧光证实无饲养层培养的细胞持续表达OCT4、SOX2和NANOG，但不表达滋养层标志物CDX2。RT-PCR和Western blot结果进一步确认其多能性未受影响。无饲养层培养的pPSC-KOFLs同样能够形成拟胚体，并表达三胚层分化标志物，证明其在无饲养层条件下仍保持完整的分化潜能。