背景知识

禽流感病毒依据其表面主要抗原HA和神经氨酸酶（neuraminidase, NA）的组合分为不同亚型，其中H6Nx属于低致病性禽流感（low pathogenicity avian influenza, LPAI），虽非OIE强制通报病种，但可在禽群中形成稳定谱系并导致产蛋下降、继发细菌感染及呼吸道病变，且东亚地区已出现禽源H6Nx病毒的人畜共患潜力。南非自2000年代初以来持续遭受H6N2疫情困扰，当地注册使用的油乳剂灭活全病毒疫苗（AVIVAC® AI）系基于2002年毒株制备，已沿用17年未更新；已有计算机模拟证据表明，该疫苗对同源亚谱系I田间毒株产生了加速遗传与抗原漂移的选择压力。传统鸡胚源灭活疫苗生产周期长、依赖SPF种蛋且存在生物安全顾虑，而病毒样颗粒（VLPs）作为自组装的蛋白纳米颗粒，在保留天然病毒表面抗原密集重复阵列的同时不含核酸核心，兼具安全性与强免疫原性，可通过抗原递呈细胞有效诱导中和抗体及T细胞应答。植物生物制药（biopharming）利用瞬时表达技术已快速、低成本地生产出多种人用HA-VLP候选疫苗并完成临床前及临床验证，但其在禽类中的保护效力此前尚未得到实验证实。

研究方法

研究首先基于南非2016年H6N2田间分离株A/chicken/South Africa/N2826/2016的HA全长序列及A/New Caledonia/20/1999（H1N1）的M2序列，设计合成密码子优化的基因并克隆至植物瞬时表达载体pEAQ-HT。将重组质粒转化农杆菌AGL1后，采用真空/手工浸润法共转化至5–8周龄、经糖工程改造去除植物特异性N-糖基的本生烟叶片。侵染6天后收获叶片，经匀浆、纱布过滤澄清及20%–60%碘克沙醇（Iodixanol）密度梯度超速离心（32 000×g，2 h）纯化，收集富含HA的20%–30%梯度组分，透析后以15%（w/v）海藻糖稳定。通过SDS-PAGE、免疫印迹（抗H6N2鸡血清为一抗）、LC-MS/MS肽段测序及透射电镜（TEM）对VLP进行鉴定与形态表征；并以血凝（HA）和HI试验验证其生物学活性。动物试验选用36只6周龄SPF白来航鸡，随机分为三组（每组12只）：A组肌肉注射植物源H6 VLP疫苗（768 HAU/0.3 mL，MontanideTM ISA 71VG佐剂）；B组注射商业灭活油乳剂疫苗AVIVAC® AI（EID₅₀ ≥ 10⁸/0.5 mL）；C组为未免疫对照。A、B组分别于6周龄首免、10周龄加强，12周龄时所有鸡群经眼鼻途径攻毒106 EID50的异源2016年H6N2田间毒株A/chicken/South Africa/H44954/2016（与VLP疫苗HA序列一致性95.77%）。分别于首免后4周、加强后2周（攻毒前）及攻毒后2周采血，通过NP-ELISA和HI试验检测抗体；攻毒后第2、3、4、7、14、21天采集口咽及泄殖腔拭子，以针对M基因的qRT-PCR定量病毒RNA载量，并以Reed-Muench法换算EID50进行标准化比较。

研究结果

植物表达系统成功生产出大量形态均一的球形VLPs，直径主要分布于70–100 nm，SDS-PAGE显示约62 kDa的HA主带及约14 kDa的M2条带，LC-MS/MS分别鉴定到44.1%和17.5%的序列覆盖率；HA产量保守估计达95 mg/kg叶片材料。血清学结果显示，首免后4周，H6 VLP组针对2016年异源抗原的HI GMT达9.3 log2，而商业疫苗组针对其同源2002年抗原的GMT仅为7.1 log2、针对2016年抗原更是低至6.0 log2；加强免疫后，VLP组GMT升至10.7 log2（2016抗原），商业疫苗组同源抗原GMT为8.8 log2、异源抗原为8.0 log2。攻毒后2周，VLP组仅2/12鸡只检出NP抗体，而商业疫苗组持续呈NP阳性，证明VLP疫苗具备DIVA（区分感染与免疫动物）兼容性。排毒动力学方面，VLP组口咽排毒比例在攻毒后3天为58%（7/12），4天升至75%（9/12），但7天降至25%（3/12），14天仅1只，21天完全停止；平均排毒量较非疫苗对照组降低>100倍，较商业疫苗组降低>105倍。相反，商业疫苗组在攻毒后前4天排毒水平与非疫苗组无统计学差异，且7–21天期间仍有58%（7/12）鸡只持续排毒，比例及平均滴度均高于非疫苗对照，提示疫苗抗原错配可能筛选出逃逸突变株并促进其在呼吸道持续复制。泄殖腔排毒结果趋势一致：VLP组仅在攻毒后7天内可检出，且3–4天即显著低于非疫苗组；商业疫苗组排毒持续至7天，非疫苗组则持续至14天。整个试验期间未观察到任何疫苗局部或全身不良反应，攻毒后亦未出现临床症状或死亡。

图 攻毒后不同时间点三组鸡（H6 VLP疫苗组、商业灭活疫苗组、未免疫对照组）从呼吸道（a）和胃肠道（b）排毒的病毒载量动态变化

结论与意义

本研究首次证实，基于植物瞬时表达平台生产的H6 VLP疫苗在鸡中不仅安全、无不良反应，而且能以单次免疫诱导高效、持久的保护性免疫应答，其效力超越需两次免疫的传统鸡胚源灭活全病毒疫苗。该疫苗对异源攻毒株表现出卓越的降低排毒负荷与缩短排毒窗口的能力，而长期使用的商业疫苗因抗原漂移错配不仅未能提供有效保护，反而可能通过免疫选择压力加剧田间病毒的持续传播与进化，这进一步凸显了快速更新疫苗毒株以匹配田间流行株的紧迫性。植物源VLP疫苗不含核蛋白（NP）及病毒核酸，天然满足DIVA策略需求，有利于田间血清学监测与疫病净化。此外，植物生物反应器无需操作活病毒，避免了SPF种蛋供应限制、生物安全隔离防护要求及内毒素污染等瓶颈，兼具伦理、环保与可持续性优势。研究估算，仅需1公斤叶片原料即可制备5000–30000羽份疫苗，且从获得HA序列到产出完全配制疫苗可压缩至21天内，一个月内可放大至千万剂规模。因此，植物生产的HA-VLP疫苗为应对不断漂移的家禽流感病毒、实现“同一健康”（One Health）框架下的源头防控提供了一种高速响应、低成本、可大规模推广的革新性技术平台，对全球尤其是资源受限地区的禽流感防控具有重大战略价值。

参考来源：Smith, T., O'Kennedy, M.M., Wandrag, D.B.R., Adeyemi, M. and Abolnik, C. (2020), Efficacy of a plant-produced virus-like particle vaccine in chickens challenged with Influenza A H6N2 virus. Plant Biotechnol J, 18: 502-512. https://doi.org/10.1111/pbi.13219.