生长最快的海洋细菌：细胞培养肉的“廉价血清”革命

这篇研究的核心目标是开发一种低成本、无动物来源的血清替代物，用于细胞培养肉生产中的培养基配方。研究团队系统筛选了多种微生物裂解液，最终发现海洋细菌Vibrio natriegens的全细胞裂解液能够有效替代胎牛血清，支持牛卫星细胞的长期增殖与分化。

研究首先对七种微生物（包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和酵母）的裂解液进行了产量评估和蛋白组成分析。结果显示，革兰氏阴性菌和酵母的蛋白产量显著高于革兰氏阳性菌，这与后者厚实的肽聚糖细胞壁难以破碎有关。SDS-PAGE分析揭示了不同物种间蛋白条带的显著差异，反映了各裂解液独特的蛋白组成特征。

在细胞相容性筛选阶段，研究采用短期增殖实验评估了各裂解液对永生化牛卫星细胞和鲭鱼肌肉细胞系的支持效果。对于未适应血清-free条件的牛卫星细胞，多数裂解液在高浓度下表现出细胞毒性，但V. natriegens和Lactobacillus plantarum的裂解液在10 μg/mL浓度下表现出与阳性对照Beefy-9培养基相当的促增殖效果。鲭鱼细胞则对酵母裂解液更为敏感，Saccharomyces cerevisiae裂解液在100 μg/mL时几乎将细胞短期增殖能力提升了一倍，效果堪比7.5%胎牛血清培养基。值得注意的是，经过无血清适应的牛卫星细胞对裂解液的响应模式发生明显改变，V. natriegens裂解液在2.5–10 μg/mL范围内呈现浓度依赖性促增殖效应，而此前表现良好的L. plantarum裂解液则失去优势，这提示细胞的营养需求状态会显著影响裂解液的适用性。

图1 多种微生物裂解液对肌肉卫星细胞性能的筛选工作流程。

基于筛选结果，研究团队选择V. natriegens裂解液进行牛卫星细胞的长期适应培养。通过逐步递增裂解液浓度的策略（从10 μg/mL经20 μg/mL最终达到40 μg/mL），细胞在约两个半月内完成适应，最终建立的VN40培养基（B8基础培养基添加40 μg/mL V. natriegens裂解液蛋白）使细胞倍增时间降至24.9小时，与含20%胎牛血清的标准培养基（21.9小时）相当。进一步采用快速适应策略（直接从20 μg/mL起始）可将适应周期缩短至四周。长期连续培养24天的对比实验显示，VN40培养基中的细胞累积倍增次数显著高于Beefy-9培养基，平均倍增时间更短（31.2 h vs 43.1 h）。显微镜观察发现，VN40培养基中的细胞汇合度更高，且胞质脂质积累明显减少，后者在Beefy-9培养基中表现为明显的脂滴形成，可能与高浓度胰岛素诱导的胰岛素抵抗或脂肪生成信号有关。

为阐明裂解液中发挥促增殖作用的活性成分，研究通过3 kDa超滤膜将V. natriegens裂解液分离为高分子量组分（>3 kDa，富含蛋白）和低分子量组分（<3 kDa，富含代谢物）。单独使用任一组分均无法达到全细胞裂解液的促增殖效果，且两个组分的联合使用与全细胞裂解液效果相当，表明蛋白组分和小分子代谢物存在协同增效作用，无需进行繁琐的组分分离即可直接使用全细胞裂解液。

在细胞特性维持方面，经过22代VN40培养基适应的牛卫星细胞保持了完整的干细胞特性。免疫荧光染色显示，适应前后Pax7阳性细胞比例均超过99%，定量成像细胞术证实卫星细胞表型未发生改变。分化实验进一步证明这些细胞仍具备成肌分化能力，能够形成成熟的多核肌管，表达早期分化标志物Desmin和晚期分化标志物肌球蛋白重链。快速适应（20→40 μg/mL）的细胞分化更为 robust，而逐步适应的细胞分化相对较弱，这可能与高代次培养对成肌能力的累积影响有关。

代谢组学分析采用四种互补的液相色谱-串联质谱方法，从V. natriegens裂解液中鉴定出155种高置信度代谢物。其中嘌呤和嘧啶衍生物（如尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤）以及芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）的色谱峰面积最为显著。这些代谢物在胎牛血清中同样存在，已知可通过提供核酸合成前体和激活MAPK信号通路促进细胞增殖，但过高浓度可能导致核苷酸失衡或细胞周期阻滞，这也解释了为何高浓度裂解液反而抑制细胞生长。

经济性分析表明，VN40培养基具有显著的成本优势。实验室规模下，40 μg/mL V. natriegens裂解液的成本仅为每升2美元，相比每升264美元的胎牛血清实现了99.2%的价格降幅。整体培养基成本从BSCGM的323.30美元/升和Beefy-9的264.85美元/升降至158.45美元/升，降幅达51%。考虑到V. natriegens是已知生长最快的非致病性细菌（代时<10分钟），其营养需求简单且培养条件灵活，工业化大规模生产有望进一步降低成本。

综上所述，该研究成功开发了一种基于Vibrio natriegens全细胞裂解液的血清-free培养基配方，通过简单的超声破碎和过滤除菌即可制备，能够以极低剂量支持牛卫星细胞的长期高效增殖，同时完整保留细胞的干细胞表型和成肌分化能力。这一策略为细胞培养肉产业提供了一种经济可行、易于规模化且完全规避动物伦理问题的血清替代方案，其筛选思路亦可推广至其他细胞类型的培养基优化。

来源：Dolgin, J., Chakravarty, D., Sullivan, S. F., Cai, Y., Lim, T., Yamaguchi, P., Balkan, J. E., Xu, L., Olawoyin, A. D., Lee, K., Kaplan, D. L., & Nair, N. U. (2024). Microbial lysates as low-cost serum replacements in cellular agriculture media formulation. Food Research International, 196, 115633. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2024.115633