CAV-2 载体标准化制备技术：助力疫苗研发与基因治疗

一、研究背景

腺病毒载体是疫苗研发与基因治疗的核心工具，具备基因容量大、转导效率高、免疫原性强、不整合宿主基因组等优势。其中，人腺病毒 5 型（HAdV-5）应用最广，但人群普遍存在预存抗体，会显著削弱疫苗效果。

犬腺病毒 2 型（CAV-2）作为替代载体优势突出：人群血清阳性率极低、可高效感染呼吸道与神经细胞、能长期稳定表达外源基因，尤其适合需多次接种的疫苗场景。目前，CAV-2 载体工业化制备缺乏标准化流程，制约了其大规模应用。为此，研究团队建立了一套高效、稳定、可放大的 CAV-2 非复制型载体制备方案。

二、研究内容

研究以E1/E3 双缺失的 CAV-2 载体为对象，依托可互补 E1 蛋白、支持病毒复制的 AD-293 细胞系，系统建立从质粒线性化到病毒滴定的完整制备流程，核心步骤如下：

质粒线性化：用 PacI 酶切释放 CAV-2 全基因组，去除细菌骨架，保障生物安全；

细胞转染：将线性化质粒转染 AD-293 细胞，启动病毒组装；

病毒扩增：转染后细胞反复冻融，大规模感染 AD-293 细胞，收获病毒原液；

离子交换纯化：采用 Vivapure Adenopack 试剂盒快速去除杂质，获得高纯度病毒；

效价测定：使用改良 Kärber 法计算 TCID₅₀，精准标定病毒感染滴度。

 图 非复制腺病毒载体生成实验室工作流程的示意概述

三、研究结果

1. 制备流程高效稳定

整套方案操作简便、重复性强，5L 规模可稳定生产高纯度 CAV-2 载体。转染后 3 天细胞即出现典型病变（CPE），呈 “葡萄串” 状脱落，病毒扩增效率高；离子交换纯化仅需 1 小时即可完成，纯度显著高于传统超速离心法，且避免了重金属污染风险。

2. 病毒质量优异

纯化后 CAV-2 载体滴度可达2.0×10¹⁶ TCID₅₀/mL，远高于常规制备水平；测序与酶切验证显示载体结构完整、无突变，完全符合安全标准。

3. 安全性有保障

非复制型 CAV-2 载体缺失关键复制基因，仅在互补细胞中增殖，感染动物后不扩散、无致病性；制备全程严格无菌操作，符合生物安全二级（BSL-2）规范。

图：CAV-2 非复制型载体制备全流程示意图（注：图中展示了从重组质粒构建、线性化处理，到 AD-293 细胞转染、病毒扩增、纯化与滴定的关键环节，直观呈现了标准化制备方案的核心步骤）

四、研究意义

本研究建立的标准化制备方案，解决了 CAV-2 载体工业化应用的瓶颈：流程简化、成本降低、纯度提升、安全性可控，适配从实验室到工业化的全规模生产需求。

CAV-2 载体凭借低预存抗体、长效表达、靶向性强等特点，在传染病疫苗、肿瘤基因治疗、神经疾病治疗等领域潜力巨大。该方案的建立，为后续新型疫苗研发、临床转化及产业化生产提供了标准化技术平台，将有力推动腺病毒载体技术在生物医药领域的广泛应用。

参考来源：Omara D, Ndekezi C, Mugaba S, Nakyanzi A, Bukenya H, et al. (2026) Practical guidelines for producing non-replicating canine adenovirus vectors. PLOS ONE 21(5): e0341642.