30 天体外共进化！噬菌体大幅拓宽宿主范围，高效杀伤多重耐药肺炎克雷伯菌

研究背景

全球抗生素耐药危机持续加剧，ESKAPEE 高危致病菌是院内感染主要元凶，其中肺炎克雷伯菌极易通过质粒获得超广谱 β 内酰胺酶、碳青霉烯酶，演化出多重耐药、泛耐药甚至碳青霉烯耐药肠杆菌（CRE），临床可用抗生素近乎枯竭；同时该菌分泌厚黏液荚膜，进一步阻碍药物接触，感染致死风险居高不下。农业与临床抗生素滥用造成跨物种交叉耐药，新型抗生素研发管线进展缓慢，亟待替代抗感染方案。

噬菌体作为特异性杀菌病毒，对人体无毒性，百年前已用于抗感染，但长期被抗生素取代。现有天然噬菌体存在两大致命短板：宿主范围极窄，单一噬菌体仅能裂解少数菌株；细菌极易快速产生噬菌体抗性，难以实现长效抑菌，极大限制临床应用。既往仅在实验室标准大肠杆菌中证实共进化可拓宽噬菌体宿主谱，但缺乏针对真实临床耐药菌株的验证，且未明确改良噬菌体对 MDR/XDR 菌株的长效抑制能力与分子突变机制。

研究结果

1. 噬菌体资源库构建与形态分型

研究从美国多地环境样本分离得到 11 株独特肺炎克雷伯菌噬菌体，基因组跨度 37.9–177.7 Kbp，分属 4 大进化支；透射电镜（TEM）观察将噬菌体分为肌尾噬菌体、短尾噬菌体、长尾噬菌体三类，Ace、APV 为本实验进化改造的目标菌株，原始宿主覆盖度仅分别为 42.37%、27.12%，宿主范围狭窄，具备改造提升空间。

图1 通过透射电子显微镜（TEM）观察克雷伯氏菌噬菌体的形态学

2. 30 天连续共进化实验体系搭建

研究建立标准化 30 天体外共进化平台：以 MOI=10 将噬菌体与临床肺炎克雷伯菌每日传代培养，每 3 天取样测定噬菌体滴度与细菌载量，30 天后分离纯化进化噬菌体，同步设置原始未进化噬菌体作为对照，分别开展宿主范围斑点裂解实验与 72h 液体生长曲线长效抑菌测试，完整实验流程如下图所示。

图2 实验设计概述

3. 进化噬菌体宿主范围显著扩增

经 30 天协同进化后，两株目标噬菌体裂解谱大幅拓宽：APV 进化株裂解菌株占比最高达 61.02%（原始仅 27.12%），Ace 进化株最高达 59.32%（原始仅 42.37%）；进化噬菌体可裂解原始噬菌体完全无法侵染的 4 个细菌进化分支，覆盖多种全新 O 抗原、荚膜血清型，同时对 ESBL 阳性、CRE 碳青霉烯耐药菌株裂解活性同步提升，仅少数重复实验组出现宿主范围小幅下降，整体改良效果稳定。

4. 进化噬菌体实现 72h 长效抑制耐药菌株生长

72h 液体培养动力学实验证实，进化噬菌体抑菌能力全面优于原始噬菌体：12 组普通临床菌株测试中 10 组长效抑制效果更好，58% 组间差异具备统计学意义；针对 28 株 MDR/XDR 临床菌株（含 CRE 高危株），75% 菌株可被进化噬菌体显著抑制生长，在长达 72 小时内持续压制细菌增殖，大幅延缓细菌产生噬菌体抗性，突破天然噬菌体短期抑菌短板。

5. 基因组测序揭示宿主范围扩张分子机制

全基因组比对显示，进化噬菌体整体基因组差异极小，Ace 株平均核苷酸差异＜0.01%，APV 株仅 0.02%；所有进化噬菌体均在 L 型尾部纤维蛋白编码区出现非同义突变，绝大多数变异集中于尾部纤维、基板功能基因簇，其中尾部纤维黏附蛋白突变数量最多；Ace 进化株存在 165nt 基因间区缺失，尾部蛋白是噬菌体识别、结合细菌荚膜与表面受体的核心元件，证实尾部结构突变是宿主范围拓宽、抑菌能力提升的核心遗传基础。

总结与展望

本研究以临床多重耐药肺炎克雷伯菌为模型，证实 30 天体外共进化可快速改造天然噬菌体，同步实现宿主范围拓宽、72 小时长效抑制耐药菌两大核心突破，基因组解析明确尾部纤维蛋白突变是表型改变的分子根源，建立了一套可复制、标准化的广谱噬菌体体外改造技术体系，弥补天然噬菌体宿主窄、易耐药的临床痛点。

从应用层面，该方法不依赖基因编辑设备，操作门槛低，可快速针对临床分离的泛耐药菌株定制高效噬菌体；且技术逻辑具备通用性，有望推广至鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等其余 ESKAPEE 耐药致病菌。后续可进一步缩短共进化周期、混合多株噬菌体同步进化构建广谱噬菌体鸡尾酒，开展体内动物感染模型验证安全性与治疗效果；同时结合尾部蛋白定点突变定向改造噬菌体受体识别能力，精准扩大裂解谱，为应对全球抗生素耐药危机提供低成本、可落地的噬菌体疗法新策略。

来源：Ghatbale P, Blanc A, Sue A, Leonard J, Bates M, Garcia AG, Hensley J, Gomes Nunes DD, Hitchcock N, Shiach J, Bardaró R, Sah G, Ghose C, Whiteson KL, Schooley RT, White RA 3rd, Cobián Güemes AG, Meyer JR, Pride DT. Experimental phage evolution results in expanded host ranges against antibiotic resistant Klebsiella pneumoniae isolates. Nat Commun. 2025 Nov 19;16(1):9903. doi: 10.1038/s41467-025-66062-7. PMID: 41258013; PMCID: PMC12630596.